本发明公布了双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中的应用。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂从开花植物中采集的花蜜与自身分泌的多种酶混合，经充分酿造而成的天然甜味食品。因蜂蜜中含有多种人体所需的维生素、氨基酸、酚酸类物质、微量元素等有益物质，深受人们喜爱。近年来，我国南方部分省市陆续爆发了多起因食用蜂蜜而致人中毒的公共卫生事件，这使得有毒蜂蜜成为食品安全领域突出问题。为此，国家食品药品监督管理局多次发布公告，提醒民众不要食用未经加工的蜂蜜。我国地域广阔，气候类型复杂多样，植物品种丰富繁多，在我国的部分区域分布着大量的有毒蜜源植物，如雷公藤、昆明山海棠、乌头、黄杜鹃和钩吻等。在有毒蜜源植物的花期，其它蜜源匮乏，有毒蜜源植物成为当地优势群落时，蜜蜂便会采集有毒蜜源植物的花蜜酿制蜜蜂。此时，有毒蜜源植物花蜜中的高毒性物质便会通过蜜蜂采集行为迁移至蜂蜜中，形成有毒蜂蜜。人们一旦误食这些有毒蜂蜜之后，便会发生中毒反应，严重者甚至致人死亡。
云南处于横断山脉地区，地势复杂，植物种类丰富多样，素有“植物王国”美称。同时，在云南的山区存在着大量的有毒蜜源植物，导致云南地区的蜂蜜中毒事件频发。农业部蜂产品监督测试测试中心联合云南省农科院多次前往云南蜂蜜中毒的事发地区，实地调研导致有毒蜂蜜的有毒蜜源植物，结果表明昆明山海棠、南烛和乌头可能是导致蜂蜜中毒的关键有毒蜜源植物。乌头属植物是多年生至一年生草本植物，属于我国传统中药植物，因其具有高毒性，中医临床上应用此药时常发生中毒事件。乌头属中的二萜类生物碱是其药效的关键成分，同时也是其毒性物质，其中双酯型乌头碱具有较强的生理活性，如中乌头碱、次乌头碱和乌头碱，三者在小鼠中的半数致死量ld50均在0.3mg/kgb.w.以下，属于剧毒性化合物。
人们在劳动生产实践中，很早便意识到了乌头是一类非常重要有毒蜜源植物。乌头的花期恰是秋季，此时蜜源植物相对匮乏，当乌头一旦成为当地的优势蜜源植物，蜜蜂便会采集其花蜜酿制有毒蜂蜜，人们误食之后，便会发生蜂蜜中毒事件。目前，有关乌头属有毒蜂蜜的研究十分匮乏，尚不清楚其有毒蜂蜜致人中毒的物质基础。乌头中哪些有毒物质通过蜂蜜的采集行为迁移至蜂蜜中，其化学结构、含量及毒性等科学问题均未得到有效的解答。
因此，急需开展乌头属有毒蜂蜜的系统研究，阐明蜂蜜中致人中毒的关键毒性物质的化学结构与含量，并基于此，建立蜂蜜中毒性物质的检测方法，用于有毒蜂蜜的识别与鉴定。
技术实现要素：
乌头属有毒蜂蜜的鉴定方法主要是基于蜂蜜中花粉形态鉴别法，但是此方法属于间接鉴别法，且判别的误差较大。而近年来我国南方部分省市蜂蜜中毒事件频发，急需开发出准确可靠的检测方法。基于此，本发明公布了双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)作为有毒蜂蜜的生物标志物，并利用此生物标志物建立乌头属有毒蜂蜜的识别和鉴定方法，此外，该检测方法还可用于蜂蜜中毒人群快速诊断。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
本发明的技术方案之一：双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)作为生物标志物在有毒蜂蜜的识别和鉴定方面的应用。
所述中乌头碱、次乌头碱和乌头碱的化学结构式如图1所示。
本发明的技术方案之二：基于液相色谱串联高分辨质谱技术建立了蜂蜜中双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)的检测方法。该方法采用uhplc-qexactiveplus检测蜂蜜样本。
首先，在蜂蜜样本进行检测之前对其采用如下前处理方法：取蜂蜜样本2g加入18ml20％甲醇水，使蜂蜜完全溶解，然后14000g、10min、4℃高速离心，取上清液1ml过0.22μm的滤膜，待上机分析。
对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容的实质相同。
进一步地，采用uhplc-qexactiveplus对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相条件如下：
流动相组成：流动相a为0.1％的甲酸水，流动相b为0.1％的甲酸乙腈。
色谱柱：为c18色谱柱；
柱温：室温，30℃。
梯度洗脱条件为：0-1.0min，5％的b；1.0-2.0min，5-20％的b；2.0-10.0min，20-80％的b；10.0-12.0min，80-100％的b；12.0-13.0min，100％的b；13-13.5min，100-5％b；13.5-15min，5％的b。
流速：0.30ml/min；进样量：5.0μl。
采用uhplc-qexactiveplus对蜂蜜样本进行检测时，所述的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速(sheathgasflowrate)45；辅助气的流速(auxgasflowrate)10；挡锥气的流速(sweepgasflowrate)0；电喷雾电压(sprayvoltage)3.5kv；离子导管的温度(capillarytemperature)320℃；s-lensrflevel设为60；离子源的温度(heatertemperature)350℃
采集的模式：正离子模式下的fμllms-ddms2：
其中fullms的具体参数设置如下：分辨率(resolution)：70000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：200-1000da；spectrumdata：centroid。
其中dd-ms2的具体参数设置如下：分辨率(resolution)：17500；agctarget：1e5；maximumit：50ms；loopcount：2；isolationwindow：2.0da；nce：40；spectrumdata：centroid。而ddsettings中，minimumagc：8.0e3；apextrigger：2-6s；excludeisotope：on；dynamicexclus：8.0s。
双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)作为乌头属有毒蜂蜜的生物标志物，通过检测蜂蜜样本中是否含有中双酯型乌头碱来鉴别有毒蜂蜜。
具体来说，通过查看其图谱中是否含有三种双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)的精确m/z值：分别为632.30670([m+h]+，c33h46no11+)、616.31127([m+h]+，c33h46no10+)、646.32123([m+h]+，c34h48no11+)，其允许偏差应在5ppm以内。所述的中乌头碱的色谱峰的保留时间应该满足6.64min，次乌头碱的色谱峰的保留时间应该满足7.02min，乌头碱的色谱峰的保留时间应该满足7.02min(允许误差应小于0.5min)。而且其ms/ms图谱(子离子图谱)中应该含有中乌头碱的特征碎片离子m/z572.28485、m/z354.16949、m/z105.03386，次乌头碱的特征碎片离子m/z556.28999、m/z524.26386、m/z338.17459、m/z105.03381，乌头碱的特征碎片离子m/z586.30078、m/z368.18503、m/z105.03380。其允许偏差应在5ppm以内。图2展示了三种双酯型乌头碱的精确ms/ms图谱。
由于高分辨质谱提供的质量数比较精确，因此该方法具有较高的特异性和灵敏度，其检出限可达0.05μg/kg。对本方法采用的相关仪器参数，不同实验室和检测机构可以依据液相色谱串联高分辨质谱技术的相关知识和实际情况，对相关参数进行一定调整。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
附图说明
图1为中乌头碱、次乌头碱和乌头碱的化学结构式。
图2为三种双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)精确质量数的ms/ms图谱；其中，(a)中乌头碱；(b)次乌头碱；(c)乌头碱。
图3为三种双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)在不同样本中的精确提取质量色谱图(rt分别为6.64min、7.02min和7.02min)；其中，(a)草乌鲜花样本；(b)草乌花蜜样本；(c)有毒蜂蜜样本；(d)大宗蜂蜜样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例的给出仅是为了说明，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的相关技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行一定的修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
等比例扩大或者缩小下述实施例所用试剂或原料的技术方案，与下述实施例的实质相同。
试验案例：
1、试验材料：草乌的鲜花、花蜜和有毒蜂蜜；
在草乌的花期9月，在云南地区采摘草乌的鲜花，并采用微量移液器吸取草乌的花蜜。此外，为了获得草乌的蜂蜜，在草乌的花期之前(约8月份)在种植基地放置4箱蜜蜂(两箱意蜂，两箱中蜂)。放置之前，除去巢脾中的蜂蜜和花粉，放置1个月之后，每个蜂箱采集100-500g蜂蜜，然后将巢脾中多余的蜂蜜销毁。
将草乌鲜花采用如下前处理方法进行处理，然后采用uhplc-qexativeplus进样分析。
前处理方法：草乌鲜花，经剪碎、组织匀浆之后，用纯甲醇提取目标物质，待上机分析。
将草乌花蜜采用如下前处理方法进行处理，然后采用uhplc-qexativeplus进样分析。
前处理方法：100μl的草乌花蜜用900μl20％甲醇水稀释，过0.22μm的滤膜，待上机分析。
将上述采集的疑似有毒蜂蜜样本采用如下前处理方法进行处理，然后采用uhplc-qexativeplus进样分析。
前处理方法：取蜂蜜样本2g加入18ml20％甲醇水，使蜂蜜完全溶解，然后14000g、10min、4℃高速离心，取上清1ml过0.22μm的滤膜，待上机分析。
以上采用uhplc-qexactiveplus进行检测时，液相条件和质谱条件如本发明前述技术方案所述一致。
通过对比中乌头碱、次乌头碱和乌头碱在色谱上的保留时间(分别为rt＝6.64min、7.02min、7.02min；允许误差应小于0.5min)、精确质量数(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱的精确质量数分别为m/z:632.30670、m/z:616.31127、m/z:646.32123)，以及精确ms/ms图谱中主要碎片离子(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱碎片离子的精确质量数分别为m/z572.28485，m/z354.16949，m/z105.03386；m/z556.28999，m/z524.26386，m/z338.17459，m/z105.03381；m/z586.30078，m/z368.18503，m/z105.03380)，且精确质量数和碎片离子的精确质量数的误差皆应当小于5ppm，确定草乌鲜花、花蜜中是否含有大量的中乌头碱。图3详细说明了草乌鲜花、花蜜和蜂蜜中含有三种双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)，而正常蜂蜜样本中则不含有相应的特征色谱峰。因此，可以推断出蜜蜂的采蜜行为将有毒蜜源植物中毒性物质双酯型乌头碱迁移并且富集在蜂蜜中。
在云南草乌种植基地中采集的草乌的鲜花、花蜜除了检测到中乌头碱之外，还检测到了次乌头碱和乌头碱(见图3c所示)，它们都属于毒性较大的双酯型乌头碱，其中中乌头碱的含量最大。鉴于三种双酯型乌头碱的高毒性和在有毒蜂蜜中的高含量，将中乌头碱、次乌头碱和乌头碱作为乌头属有毒蜂蜜的生物标志物。
2、在草乌的花期之后，在云南存在草乌大片群落的地区采集疑似有毒蜂蜜样本6份。这些蜂蜜样本按照本发明所述的前处理方法处理之后，由uhplc-qexactiveplus分析，试验结果表明6份样本中，4份为三种双酯型乌头碱阳性。可见，在草乌等乌头属有毒蜜源植物的花期采集的蜂蜜具有一定的风险，人一旦误食便可能发生蜂蜜中毒，同时，本发明的结果展示了三种双酯型乌头碱在识别和鉴定乌头有毒蜂蜜中的可靠性。
3、从市场或者蜂农那里购买大宗蜂蜜样本20份，如枣花蜂蜜、油菜蜂蜜、椴树蜂蜜、百花蜂蜜、龙眼蜂蜜以及荔枝蜂蜜等。
将在全国范围内采集的20余份不同品种的蜂蜜样本作为空白对照，验证结论的可靠性。结果显示，采集的20份大宗蜂蜜样本均为空白。图3d展示了大宗蜂蜜中三种乌头碱的精确质量数提取离子流色谱图，三者均为空白，由此确定，将双酯型乌头碱(中乌头碱、次乌头碱和乌头碱)作为乌头碱类有毒蜂蜜的生物标志物最为科学合理。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。