一种用于白细胞分类的溶血剂的制作方法

本发明涉及血液细胞分析检测领域，尤其涉及的是一种用于白细胞分类的溶血剂。

背景技术：

正常的外周血白细胞一般分为五类，即淋巴细胞(lym)、单核细胞(mon)、中性粒细胞(neu)、嗜酸性粒细胞(eos)、嗜碱性粒细胞(baso)。在临床分析领域，针对不同种类的白细胞进行准确地检测对于诊断和研究有着非常重要的作用。

目前市场上的三分类血液细胞分析仪采用阻抗法只能将白细胞分为小细胞、中间细胞、大细胞三个亚群，不能对白细胞进行准确地分类，在临床分析领域存在一定的局限性。随着当今社会科技水平的不断提高，五分类血液细胞分析仪普遍采用激光散射法或组合其他方法对白细胞进行分类，使得检测结果更加精准。

而采用激光散射法对白细胞分类首先需要利用溶血剂中的表面活性剂对白细胞进行打孔处理，不同种类的白细胞在经由溶血剂处理后会发生不同程度的皱缩；然后在通过核酸染料对细胞核进行染色标记，经过核酸染料染色后的不同的白细胞的散射光强度也有所不同。染料的使用最大的缺点是毒性较大，不仅危害操作人员的身体健康，还会对环境造成污染。同时，核酸染料成本高，增加试剂和仪器研发的复杂性。

美国专利518733中将白细胞区分为四类的方法采用含有季铵盐阳离子表面活性剂的溶血剂使得四种亚群的白细胞发生不同程度的皱缩。同时试剂中的核酸染料对白细胞核进行染色，使得四种亚群的白细胞的低射光强度产生差异。通过不同角度的散射光的分析，实现对白细胞的四分群。该专利虽然实现了对白细胞较为准确地区分，但是其试剂的研发成本和仪器的复杂性升高，其性价比不适用于那些中小型的客户。

cn200810106893.2公开的溶血剂中使用了大量的长链季铵盐表面活性剂，其种类较多，对红细胞溶血的同时对白细胞破坏性也很大。

美国专利4751179公开的溶血剂，在其相应的血细胞分析仪上能够将白细胞分为四种亚群，然而该试剂在与血细胞作用时需要维持在70℃左右的温度，才能很好地发生反应。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的用于白细胞分类的溶血剂，可以将白细胞区分为淋巴细胞(lym)、单核细胞(mon)、中性粒细胞(neu)和嗜酸性粒细胞(eos)四种亚群，不需要添加任何染料，降低试剂和仪器研发的复杂性，旨在解决现有技术中白细胞分类技术存在的操作复杂的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于白细胞分类的溶血剂，其中，包括以下组分：

阳离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、ph为2～9的缓冲液、渗透压调节剂、促溶剂和抗菌剂；

所述阳离子表面活性剂包括至少一种季铵盐阳离子表面活性剂和至少一种杂环类阳离子表面活性剂；

所述季铵盐阳离子表面活性剂的浓度为0.1～100g/l；

所述杂环类阳离子表面活性剂的浓度为0.1～100g/l；

所述非离子表面活性剂的浓度优选为1～50ml/l；

所述缓冲液的ph维持在2～9的范围内；

所述渗透压调节剂的浓度为1～20g/l；

所述促溶剂的浓度为1～20ml/l；

所述抗菌剂的浓度为0.01～10g/l或0.01～10ml/l。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，

所述季铵盐阳离子表面活性剂，具有如式(ⅰ)所示的结构：

式(ⅰ)中，r1选自c8-20的烷基、烯基或者炔基；r2、r3、r4选自c1-4的烷基、烯基或者炔基；x-选自卤素类阴离子或含氧酸根离子；

所述杂环类阳离子表面活性剂具有如式(ⅱ)所示的结构：

式(ⅱ)中，r1为c8-22的烷基、烯基或者炔基；x-选自卤素类阴离子。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述季铵盐阳离子表面活性剂选自八烷基三甲基溴化铵、八烷基三甲基氯化铵、十烷基三甲基溴化铵、十烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基乙基溴化铵、十二烷基二甲基乙基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基二甲基乙基溴化铵、十四烷基二甲基乙基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基二甲基乙基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十八烷基二甲基乙基溴化铵、十八烷基二甲基乙基氯化铵中的一种或几种的任意组合；

所述杂环类阳离子表面活性剂选自吗啡环、吡啶环、咪唑环、吡嗪环和喹啉环中的一种或几种。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述杂环类阳离子表面活性剂为吡啶环类阳离子表面活性剂。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型、乙二醇、吐温系列、曲拉通型表面活性剂中的一种或几种。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述缓冲液选自pbs缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、硼酸缓冲液、br缓冲液或碳酸缓冲液中的一种或几种。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述渗透压调节剂选自甲基脲或无机盐。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述促溶剂选自乙醇、乙二醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、丁醇和丁二醇中的一种或者多种任意组合。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述溶血剂中的抗菌剂选自盐酸普鲁卡因、哌啦西啉钠、prolin系列、咪唑系列、naf、苯酚、醛类、酰胺系列中的一种或多种的任意组合。

所述的用于白细胞分类的溶血剂，其中，所述季铵盐阳离子表面活性剂的浓度为0.1～75g/l；

所述杂环类阳离子表面活性剂的浓度为0.2～60g/l；

所述非离子表面活性剂的浓度为1～15ml/l；

所述缓冲液的ph为3～7；

所述促溶剂的浓度为3～15ml/l；

所述抗菌剂的浓度为0.01～5g/l或0.01～5ml/l。

本发明的有益效果：采用本发明的溶血剂在帝迈的血液细胞分析仪上能够使白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞四个亚群。本发明所述的溶血剂不含染料，对细胞不进行染色即可通过激光散射法对白细胞进行分类，减少对环境的危害，降低了试剂和仪器的研发成本和复杂性，适用于广大的医疗机构。

附图说明

图1a-图1d是本发明中采用实施例1所配置的溶血剂进行溶血实验的测试结果图。

图2a-图2d是本发明中采用实施例2所配置的溶血剂进行溶血实验的测试结果图。

图3a-图3d是本发明中采用实施例3所配置的溶血剂进行溶血实验的测试结果图。

图4a-图4d是本发明中采用实施例4所配置的溶血剂进行溶血实验的测试结果图。

图5a-图5d分别为本发明中实施例1-5的白细胞分类图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。

本发明提供了一种用于白细胞分类的溶血剂，包括以下几种组分：

阳离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、ph为3～7的缓冲液、渗透压调节剂、促溶剂和抗菌剂。

所述阳离子表面活性剂选自伯胺盐、仲胺盐、叔胺盐、季铵盐、杂环、鎓盐阳离子表面活性剂中的一类或几类。优选地，所述阳离子表面活性剂包括至少一种季铵盐阳离子表面活性剂和至少一种杂环类阳离子表面活性剂。

所述季铵盐阳离子表面活性剂的作用是溶解红细胞，消除红细胞对白细胞分类的影响，同时要对白细胞膜进行处理，使得淋巴、单核、中性粒细胞、嗜酸性细胞发生不同程度的皱缩。

所述季铵盐阳离子表面活性剂，具有如式(ⅰ)所示的结构：

其中，r1可以选自c8-20的烷基、烯基或者炔基；r2、r3、r4能够独立地选自c1-4的烷基、烯基或者炔基。x-选自卤素类阴离子或含氧酸根离子。

所述季铵盐阳离子表面活性剂选自八烷基三甲基溴化铵、八烷基三甲基氯化铵、十烷基三甲基溴化铵、十烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基乙基溴化铵、十二烷基二甲基乙基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基二甲基乙基溴化铵、十四烷基二甲基乙基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基二甲基乙基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十八烷基二甲基乙基溴化铵、十八烷基二甲基乙基氯化铵中的一种或几种的任意组合。所述季铵盐表面活性剂的浓度为0.1～100g/l，优选为0.1～75g/l。

所述溶血剂中的杂环类阳离子表面活性剂用量较季铵盐阳离子表面活性剂用量要少，其作用主要是在季铵盐表面活性剂溶解红细胞后能够对白细胞做微弱的处理，使其表现出不同程度的收缩。

所述杂环类阳离子表面活性剂具有如式(ⅱ)所示的结构：

其中，r1为c8-22的烷基、烯基或者炔基；x-选自卤素类阴离子。

所述杂环类阳离子表面活性剂可以选自吗啡环、吡啶环、咪唑环、吡嗪环和喹啉环中的一种或几种。所述溶血剂中的杂环类阳离子表面活性剂优选为吡啶环类阳离子表面活性剂。所述杂环类阳离子表面活性剂的浓度为0.1～100g/l，优选为0.2～60g/l。

所述非离子表面活性剂对红细胞也有一定的溶血能力，同时对白细胞膜也会进行一定的处理。非离子表面活性剂在溶血剂中也存在一定的乳化作用，使得表面活性剂能够均匀分散。所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型、乙二醇、吐温系列、曲拉通型表面活性剂中的一种或几种。所述非离子表面活性剂的浓度优选为1～50ml/l，优选为1～15ml/l。

所述溶血剂中的缓冲液能够保持ph不变，为血液细胞保持一个相对稳定的理化环境，便于白细胞的精确分类和检测。所述缓冲液选自pbs缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、硼酸缓冲液、br缓冲液或碳酸缓冲液中的一种或几种。所述缓冲液的ph维持在2～9的范围内，优选为3～7的范围。

所述溶血剂要使白细胞保持一定的形态，渗透压也是一个重要的因素。所述溶血剂中的渗透压调节剂选自甲基脲或无机盐。所述渗透压调节剂的浓度为1～20g/l。

所述溶血剂中存在大量的表现活性剂等有机物，为了促进其更好的溶解，可以适当的加入极性较强的物质促进其在水溶液中的溶解。所述促溶剂选自乙醇、乙二醇、丙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、丁醇和丁二醇中的一种或者多种任意组合。所述促溶剂的浓度为1～20ml/l，优选为3～15ml/l。

所述溶血剂中的抗菌剂的作用是为了有效杀灭细菌和抑制微生物的生长，防止溶血剂发生霉变。所述溶血剂中的抗菌剂选自盐酸普鲁卡因、哌啦西啉钠、prolin系列、咪唑系列、naf、苯酚、醛类、酰胺系列中的一种或多种的任意组合。所述抗菌剂的浓度为0.01～10g/l或0.01～10ml/l，优选为0.01～5g/l或0.01～5ml/l。

本发明所述溶血剂的制备方法，直接将上述原料按照浓度要求混合均匀，并准确定容，进行过滤，用于本公司特定的血液细胞分析仪。所述溶血剂的使用方法与市面常规溶血剂相同，在此不赘述。

下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1

取25份临床静脉全血样本，在帝迈df50血液细胞分析仪上采用本实施例1所配置的溶血剂进行实验，同时在迈瑞bc-5180血液细胞分析仪上使用迈瑞原装溶血剂进行实验，在excel中对两者结果进行处理，以迈瑞bc-5180上的测试结果为纵坐标，采用本实施例1测试结果为横坐标，如图1a-图1d所示，从图中可以看出，结果与在迈瑞bc-5180上的测试结果具有较好的线性关系。

实施例2

取25份临床静脉全血样本，在帝迈df50血液细胞分析仪上采用本实施例2所配置的溶血剂进行实验，同时在迈瑞bc-5180血液细胞分析仪上(使用迈瑞原装溶血剂)进行实验，在excel中对两者结果进行处理，以迈瑞bc-5180上的测试结果为纵坐标，采用本实施例2测试结果为横坐标。如图2a-图2d所示，从图中可以看出，结果与在迈瑞bc-5180上的测试结果具有较好的线性关系。

实施例3

取25份临床静脉全血样本，在帝迈df50血液细胞分析仪上采用本实施例3所配置的溶血剂进行实验，同时在迈瑞bc-5180血液细胞分析仪上(使用迈瑞原装溶血剂)进行实验，在excel中对两者结果进行处理，以迈瑞bc-5180上的测试结果为纵坐标，采用本实施例3测试结果为横坐标。如图3a-图3d所示，从图中可以看出，结果与在迈瑞bc-5180上的测试结果具有较好的线性关系。

实施例4

用此组分和配比完成的溶血剂ph为6.0

取25份临床静脉全血样本，在帝迈df50血液细胞分析仪上采用本实施例4所配置的溶血剂进行实验，同时在迈瑞bc-5180血液细胞分析仪上使用迈瑞原装溶血剂进行实验，在excel中对两者结果进行处理，以迈瑞bc-5180上的测试结果为纵坐标，采用本实施例4测试结果为横坐标。如图4a-图4d所示，从图中可以看出，结果与在迈瑞bc-5180上的测试结果具有较好的线性关系。

图5a-图5d中的(a)、(b)、(c)、(d)分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4溶血剂在df50上面实验时对应的白细胞分类图。白细胞在diff通道类与本溶血剂作用，被本发明的溶血剂处理后，通过激光散射法分成了四种亚群，分别是淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞。图5a(a)为实施例1测试结果的白细胞分类图，能够看到四种分类细胞的散点图，每种白细胞散点之间分散较好；图5b(b)为实施例2测试结果的白细胞分类图，四种白细胞都能够明显分开，各部分的散点重合较小，分类效果较好；图5c(c)为实施例3测试结果的白细胞分类图，四种白细胞都能够明显分开，每一部分的聚合程度较好，分类效果较好；图5d(d)为实施例4结果的白细胞分类图，四种白细胞结果都能够明显分开，每一部分的聚合程度较好，分类效果明显。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。