本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及用于预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效的新标志物以及它们在制备预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效的产品中的用途。
背景技术：
：：肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是每年造成死亡人数最多的癌症类型。其中，65-70％非小细胞肺癌患者确诊时为不宜手术的ⅢB/Ⅳ期，化疗是最主要的治疗手段。非小细胞肺癌标准的一线化疗是以铂类为主的联合方案(培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、长春瑞宾等联合顺铂、卡铂等)。其中，培美曲塞联合铂类化疗方案以其疗效好，毒性低的特点，目前已成为治疗晚期非小细胞肺癌(非鳞癌)的首选化疗方案。该方案能够延长患者生存期，改善生存质量，但有效率仅为30％～40％，中位生存期约10个月，几乎所有病人都面临耐药、复发的问题，甚至有些患者在化疗1-2周期后的首次评效中，疾病就进展，表现为对该化疗方案的原发耐药。因此，如何在治疗前为病人匹配有可能使其获益的化疗方案值得深入探索。目前，在临床上还没有能够在化疗前准确预测以铂类为主的联合方案(特别是，培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂))治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效的分子标志物。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)的疗效。在本研究中，发明人收集了354例ⅢB/Ⅳ期一线采用培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)的肺腺癌患者化疗前血清，并利用高效液相色谱-串联质谱方法检测了其代谢组学特征谱。实验结果显示，化疗方案疗效与患者血清代谢谱具有紧密的关系：对于一线化疗后两周期评效结果为疾病进展、疾病稳定及部分缓解的病人，其血清代谢组学有明显的差异。在这些代谢产物中，发明人鉴定并确认了7种具有明显差异的代谢产物(亚牛磺酸(Hypotaurine)、尿苷(Uridine)、十二烷酰肉毒碱(Dodecanoylcarnitine)、胆碱(Choline)、二甲基甘氨酸(Dimethylglycine)、尼克酰胺(Niacinamide)、十六烷酰肉毒碱(L-palmitoylcarnitine))，并以此建立了一种预测化疗预后的逻辑回归模型。因此，本发明的一个目的是提供一组用于预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效的标志物。本发明的另一个目的是提供上述标志物在用于预测培美曲塞联合铂类治疗非小细胞肺癌疗效的产品中的用途。本发明的再一个目的是提供一种用于预测培美曲塞联合铂类治疗非小细胞肺癌疗效的的试剂盒。本发明的还一个目的是提供一种预测化疗(特别是，培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗)预后的方法。根据一个方面，本发明提供了一组用于预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效的标志物，所述标志物为亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺和十六烷酰肉毒碱。优选地，所述非小细胞肺癌是肺腺癌。优选地，所述铂类为选自顺铂和卡铂中的一种或多种。根据另一个方面，本发明提供了一种检测标志物的试剂在用于预测培美曲塞联合铂类治疗非小细胞肺癌疗效的产品中的用途，所述标志物为亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺和十六烷酰肉毒碱。上述用途中，优选地，所述非小细胞肺癌是肺腺癌。上述用途中，优选地，所述铂类为选自顺铂和卡铂中的一种或多种。根据再一个方面，本发明提供了亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺和十六烷酰肉毒碱作为标志物在制备预测培美曲塞联合铂类治疗非小细胞肺癌疗效的产品中的用途。上述用途中，优选地，所述非小细胞肺癌是肺腺癌。上述用途中，优选地，所述铂类为选自顺铂和卡铂中的一种或多种。根据又一个方面，本发明提供了一种用于预测培美曲塞联合铂类治疗非小细胞肺癌疗效的的试剂盒，所述试剂盒包括：检测标志物的试剂，其中，所述标志物为亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺和十六烷酰肉毒碱。上述试剂盒中，优选地，所述非小细胞肺癌是肺腺癌。上述试剂盒中，优选地，所述铂类为选自顺铂和卡铂中的一种或多种。根据还一个方面，本发明提供了一种预测化疗(特别是，培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗)预后的方法，该方法包括测定患者化疗前血清样本中亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺和十六烷酰肉毒碱的含量的步骤。本发明的上述方法中，优选地，在含量确定后，带入逻辑回归公式g(z)＝1/(1+e-z),其中，z＝-10.312+6.81E-07X1+1.30E-07X2+1.55E-07X3+1.29E-09X4-3.10E-08X5-1.66E-07X6-4.04E-8X7(X1,亚牛磺酸；X2,尿苷；X3,十二烷酰肉毒碱；X4,胆碱；X5,二甲基甘氨酸；X6,尼克酰胺；X7,十六烷酰肉毒碱)，得到的g(z)大于0.155时，即被判定为疾病进展(PD)，小于等于0.155时，判定为疾病控制(DC)。此外，本发明还发现三个化合物的组合：胆碱、甜菜碱、二甲基甘氨酸与培美曲塞单药耐药相关。这三个化合物的组合能够通过一系列反应产生肌氨酸和甘氨酸，后者被认为参与肿瘤代谢，为一碳代谢提供一碳单位。培美曲塞是通过抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、甘氨酰胺核糖核酸甲酰基转移酶的活性，从而抑制叶酸合成进而影响一碳单位代谢。因此，本发明人确定，这三个代谢产物在PD组中含量较高，意味着一碳单位充足，从而能够抵消培美曲塞造成的一碳代谢障碍，从而导致耐药。因此，本发明的还一个目的是提供检测胆碱、甜菜碱和二甲基甘氨酸的试剂在制备预测培美曲塞单药耐药的产品中的用途。本发明的又一个目的是提供胆碱、甜菜碱和二甲基甘氨酸作为标志物在制备预测培美曲塞单药耐药的产品中的用途。本发明是第一次通过对大样本的血清进行代谢组学检测，来预测化疗的疗效。本发明鉴定并确认了7种具有明显差异的代谢产物(亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺、十六烷酰肉毒碱)，并以此建立了一种预测化疗预后的逻辑回归模型，以确定上述具有明显差异的代谢产物组合是否能够作为标志物用于预测培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)治疗非小细胞肺癌(特别是，肺腺癌)疗效。本发明的标志物及以此建立的模型能够在病人接受化疗前，预测其对该化疗方案的疗效，敏感性可达90.8％，特异性达到79.5％。本发明具有极大的临床意义，本发明通过对病人化疗前血清代谢分子标志物的检测，能够预测其化疗的预后，对于检测结果为对该化疗方案原发耐药的患者，我们将在其实施化疗前给予更有可能获益的个体化治疗方案。该实验方法还将应用于其他化疗方案，以期对临床现行的非小细胞肺癌化疗方案建立准确的预后预测图谱，从而实现建立在准确分子分型基础上的个体化治疗。附图说明图1为显示本发明实施例中的病例分组信息的图。其中：PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。图2显示本发明实施例中采用的液相色谱-质谱参数设置。图3为本发明实施例中治疗前血清样本代谢组学检测的主成分分析图。其中：PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。其中：PD样本由“PD-编号”表示；SD样本由“SD-编号”表示；PR样本由“PR-编号”表示。图4为显示本发明实施例中治疗前血清样本代谢组学检测的结果的图。其中：A.由样品类型(列)分组的85个显著改变的离子特征(行)的无监督层次聚类的热图表示。PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。ESI+和ESI-分别表示在正和负电喷雾电离模式中检测到的特征。黑色到白色阴影分别表示相对于所有样本中平均水平的离子特征的增加和减少(参见色标)。B.基于85个离子特征的发现组中的样品的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的分数曲线。深灰色，疾病进展(PD)样本(图中样本编号为PD-1，PD-2，…：由“PD-编号”表示)；白色，病情稳定(SD)样本(图中样本编号为SD-1，SD-2，…：由“SD-编号”表示)；浅灰色，部分缓解(PR)样本(图中样本编号为PR-1，PR-2，…：由“PR-编号”表示)。C.对85个离子特征项目中重要性的重要性(VIP)进行说明。每列表示PLS-DA模型中的一个特征(图4B)。误差线表示平均值的标准误差(S.E.M)。图5为显示本发明实施例中得到的11个具有差异的代谢产物的相对含量的图。其中：DC，疾病控制组，由灰色表示；PD，疾病进展组，由黑色表示。图6为显示本发明实施例中得到的11个具有差异的代谢产物在培美曲塞单药治疗患者血清中的相对含量的图。其中：DC，疾病控制组，由灰色表示；PD，疾病进展组，由黑色表示。其中：*,p<0.05；**,p<0.01。图7为显示本发明实施例中5折交叉验证结果的图。图8为显示实施例中的逻辑回归模型。其中：A,C.逻辑回归模型区分PD样品和DC样品的受试者工作特征曲线。B,D.发现组和验证组中每位患者的逻辑回归值。逻辑回归公式为g(z)＝1/(1+e-z),其中z＝-10.312+6.81E-07X1+1.30E-07X2+1.55E-07X3+1.29E-09X4-3.10E-08X5-1.66E-07X6-4.04E-8X7(X1,亚牛磺酸；X2,尿苷；X3,C12:0-肉毒碱；X4,胆碱；X5,二甲基甘氨酸(DMG)；X6,尼克酰胺；和X7,C16:0-肉毒碱)。E,F.利用该模型对PFS和OS的预测。*,p<0.05。图9显示本发明实施例中预后预测分析的工作流程。其中：A.正离子模式下血清标本的典型基峰。B.亚牛磺酸、尿苷、十二烷酰肉毒碱、胆碱、二甲基甘氨酸、尼克酰胺、十六烷酰肉毒碱7种代谢产物的代谢产物鉴定和定量分析。C.三个样本的逻辑回归值(g(z))和结果预测。D.通过比较三名代表性患者在基线(治疗前)和两个治疗周期(治疗后)的CT成像，根据RECIST1.1版对培美曲塞-铂化疗疗效的典型评估。PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。由医生评估图像下提供的肿瘤大小。具体实施方式以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂、材料、仪器等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。实施例一、实验方法1、病例信息本研究共纳入389例从2014年9月-2016年12月期间，北京大学肿瘤医院胸内一科，经病理学、细胞学及影像学确诊为晚期(IIIB或IV期)的肺腺癌患者，这些患者均一线采用培美曲塞联合铂类(顺铂/卡铂)进行化疗。其中，21例患者由于毒副反应或化疗期间发现EGFR或ALK基因突变而未完成两周期化疗，24例患者未收集到化疗前血清，最终，我们共收集到354例符合条件的化疗前血清标本，用以代谢组学检测(见图1)。2、血清处理本研究收集的病人血清样品，均严格采用统一的收集、处理和保存方法：病人在接受化疗前一周内，采用内含惰性分离胶和促凝剂的黄色采血管，于早晨空腹状态下采血3.5mL，静置1小时后，1200g离心10min(4℃)，取上层血清，-80℃保存。血清在运输过程中用干冰保护。3、代谢产物提取血清代谢产物包括水溶性代谢产物和脂溶性代谢产物两部分，分别采用以下方法进行提取。1)水溶性代谢产物提取：血清于4℃条件下解冻，充分涡旋后取100μL，加入400μL甲醇(-80℃预冷)，涡旋30s，于-80℃放置6-8小时后，12000g离心10min(4℃)，吸取上层溶液(300μL)，冻干。用80μL80％甲醇水溶液复溶，涡旋30s，4℃放置15分钟后12000g室温离心20min，取20μL上清进样检测。2)脂溶性代谢产物提取：血清于4℃条件下解冻，充分涡旋后取100μL，加入400μL氯仿/甲醇(2:1，v/v)，涡旋30s，10000g室温离心10min，吸取下层有机相(200μL)，冻干。用150μL氯仿/甲醇(2:1，v/v)复溶，涡旋30s，12000g室温离心15min，取20μL上清进样检测。4、代谢产物检测本研究使用QExactiveorbitrap(Thermo)质谱仪进行非靶向代谢组学检测。在正离子模式中，流动相A和B分别用95％和50％乙腈(含10mM甲酸铵，0.1％甲酸)。使用AtlantisHILIC二氧化硅柱，柱温35℃。分离始于1％流动相B，流速300μL/min。在负离子模式中，流动相A和B分别用95％和50％乙腈(含10mM甲酸铵，pH值用氨水调至9.0)。使用BEHAmide柱(2.1mmx100mm,Waters)进行液相色谱分离，柱温35℃。分离始于5％流动相B，流速250μL/min。脂质分析也采用QExactiveorbitrap(Thermo)质谱仪进行检测。在正离子模式中，流动相A为60％乙腈(含10mM乙酸铵)；流动相B为10％/90％乙腈/异丙醇(v/v)。使用XSelectCSHC18(2.1mmx100mm,Waters)柱，柱温45℃，流速250μL/min。详细的质谱参数见图2。所有的流动相均为新鲜配置，以消除细菌污染。为了验证数据的准确性，我们设置了质量控制样品(QC，qualitycontrol,抽取所有样品等量体积后充分混合)，在检测样品前加5个质控，每10个样品中间加一个质控。所有样品的检测顺序均为随机，避免系统误差带来的不稳定性因素。二、实验结果1、样品分组信息我们将354例血清样本(见表1)分为发现样本集(发现组，251例)和验证样本集(验证组，103例)，发现样本集用以建立分子预测模型，验证样本集用以对其进行验证。病例分组信息见图1。样本又根据化疗两周期后的评效结果分为疾病控制组(DC，diseasecontrol)和疾病进展(PD，progressivedisease)组，其中，疾病控制组包含部分缓解(PR，partialresponse)和疾病稳定(SD，stabledisease)的患者。疾病控制组被认为对该化疗方案敏感的患者，疾病进展组被认为对该化疗方案耐药的患者。表1注：PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。年龄，性别，吸烟状况，疾病分期及ECOG评分在发现组和验证组中无统计学差异。2、血清样本代谢组学检测我们用液相色谱-串联质谱先对发现样本集中的251例血清标本进行了非靶向代谢组学检测。其中，质控样本(QC)在主成分分析中能够紧密的聚类在一起，证明了检测的稳定性和可重复性好(见图3)。对代谢指纹图谱中的代谢特征分子进行提取，共得到1373个正离子模式(ESI+)和1014个负离子模式(ESI-)的特征分子。其中，379(229ESI+和150ESI-)个特征分子在疾病控制组(包括PR和SD)和疾病进展组中具有显著差异(WilcoxonP<0.05)。其中有90个特征分子具有与化疗后临床评效相似的趋势，且其中有85个属于水溶性代谢产物(图4A)，我们对这85个特征分子进行了后续分析。3、与化疗疗效相关的代谢产物鉴定我们用该85个特征分子做偏最小二乘的判别分析，疾病控制组与疾病进展组具有很明显的不同的代谢特征(图4B)，其中，32个特征分子的VIP值大于1(图4C)。我们将这32个特征分子的准确质量数、保留时间及二级碎片离子信息在TheHumanMetabolomeDatabase(HMDB,http://www.hmdb.ca/),KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG,http://www.genome.jp/kegg/),METLIN(http://metlin.scripps.edu/),andMassBank(http://www.massbank.jp/)等代谢组学数据库中进行了比对，最后确认了11个化合物：亚牛磺酸(hypotaurine)、牛磺酸(taurine)、胆碱(choline)、甜菜碱(betaine)、二甲基甘氨酸(dimethylglycine)、尿苷(uridine)、十二烷酰肉毒碱(Dodecanoylcarnitine)、十六烷酰肉毒碱(L-palmitoylcarnitine)、棕榈酰胺(palmiticamide)、咪唑-4-乙醛(imidazole-4-acetaldehyde)及尼克酰胺(niacinamide)(见图5)。鉴于培美曲塞是一种叶酸代谢抑制剂，我们检测了这11种化合物是否与培美曲塞单药耐药相关。我们共收集18例使用培美曲塞单药治疗的化疗前血清样本(6例为PR，6例为SD，6例为PD)，代谢组学检测鉴定出了三个与培美曲塞单药耐药相关的化合物：胆碱、甜菜碱、二甲基甘氨酸(见图6)。4、逻辑回归模型构建我们分别用11个变量做了逻辑回归模型，并用似然得分值选择最佳模型。其中，用7-11个变量得到的逻辑回归模型的似然得分值相似(99.269-101.54)，比用1-6个变量得到的逻辑回归模型的似然得分值高。用5折交叉验证法进一步证明，含7个变量的逻辑回归模型为最佳回归模型(MSE最低)(见图7)。该模型包含的7个化合物包括：亚牛磺酸(Hypotaurine)、胆碱(Choline)、二甲基甘氨酸(Dimethylglycine)、尿苷(Uridine)、十二烷酰肉毒碱(Dodecanoylcarnitine)、十六烷酰肉毒碱(L-palmitoylcarnitine)、尼克酰胺(Niacinamide)。判别模型根据逻辑回归[g(z)]建立，我们使用受试者工作曲线得到了曲线下面积可达0.912(见图8A)。5、模型验证为了验证该判别模型的准确性，我们对验证样本集中103例血清样品进行了同样的代谢组学检测。这7个化合物在验证样本集中的含量与发现样本集中类似。验证样本集受试者工作曲线下面积为0.9092(见图8C)。我们针对354例样本综合分析，根据尤登指数，设定了阈值为0.155。g(z)大于0.155将被判定为疾病进展，小于等于0.155将被判定为疾病得到控制。在这个阈值下，该模型准确性为90.8％特异性为79.5％。我们进一步分析了该模型对PFS及OS的预测价值。利用该模型判别为DC和PD的病人，PFS具有显著的差异(图8E)，OS没统计学差异(见图8F)。6、预后预测流程为了推进该模型的临床应用，我们分别选取了三份化疗前血清，其2周期化疗后评效结果分别为PR，SD及PD。我们分别对这三个样品进行了代谢组学检测，并利用逻辑回归模型分别计算了其逻辑回归值g(z)，得到的数值分别为0.045,0.112及0.882，根据之前设定的阈值(0.155)，前两例被判别为DC，后一例被判别为PD，这与临床影像学评效结果一致(见图9)。本发明参考CHARMSchecklists要求进行了仔细设计，包括发现样本集和验证样本集的合理设置。通过对大样本的血清样本的代谢组学检测，我们根据其中7个代谢产物建立了逻辑回归模型，该模型能够在化疗前预测该化疗方案可能的疗效。该预测模型能够很容易转化为临床应用，为传统的化疗精确的选择可能获益人群，增加其疗效。代谢组学，鉴于其与表型密切的关系及对诸多因素的敏感性，已经被广泛用于分子标志物筛选。作为基因组、转录组及蛋白质组学下游的组学技术，代谢组学能够捕捉生物体微笑的变化，即使在基因或蛋白质水平上体现不出变化，代谢产物的变化为寻找潜在的分子标志物提供了更大的可能。内源性代谢产物比基因、转录产物及蛋白质少，且具有相似的基本结构，使得代谢数据更容易整合分析。代谢组学研究对象可以是血浆、尿液等体液，可以通过微创获得，且研究费用较基因组、蛋白质组更便宜，更容易转化为临床使用。代谢产物含量低，容易收到各种因素的干扰，因此代谢数据需要反复验证才能够保证其一致和可重复性。传统的预测化疗疗效的分子标志物的失败，往往是由于化疗的靶点不是单纯的某个基因或者蛋白，而往往针对的是某些生物过程，如细胞增值或细胞凋亡，而这些过程往往可被肿瘤的代谢影响，从而在血清代谢组学中反映出来。牛磺酸是一种含硫的有机化合物，其生物学功能主要包括参与生物递质，细胞膜稳定性及钠、钾、钙、镁等金属离子的运输。亚牛磺酸是半胱氨加双氧酶的酶解产物，在生理条件下作为还原剂发挥抗氧化功能。亚牛磺酸可被亚牛磺酸脱氢酶氧化为牛磺酸。肉毒碱可被酰化为十二烷基肉毒碱和十六烷基肉毒碱，参与有机化合物的新陈代谢。这些代谢产物参与生物合成，离子运输，生理保护，在发明中发现其与该化疗方案的耐药相关。此外，本发明还发现三个化合物：胆碱、甜菜碱、二甲基甘氨酸，与培美曲塞单药耐药相关。这三个化合物能够通过一系列反应产生肌氨酸和甘氨酸，后者被认为参与肿瘤代谢，为一碳代谢提供一碳单位。培美曲塞是通过抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、甘氨酰胺核糖核酸甲酰基转移酶的活性，从而抑制叶酸合成进而影响一碳单位代谢。因此，本发明人认为，这三个代谢产物在PD组中含量较高，意味着一碳单位充足，从而能够抵消培美曲塞造成的一碳代谢障碍，从而导致耐药。综上，7个代谢产物从32个VIP大于1的特征分子中通过数据库比对鉴定出来。这些化合物主要涉及到氨基酸、脂肪酸及嘌呤代谢，这些通路与肿瘤进展及耐药积极相关。尿苷是嘌呤代谢中重要的代谢产物，在合成RNA、糖原及生物膜过程中发挥重要的作用。当前第1页1 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