本发明涉及一种基于19f-nmr技术检测利奥西呱与血清白蛋白相互作用的方法，可应用于检测利奥西呱与各类白结合，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
确定靶受体，进行配体筛选与优化，发现药物先导化合物是新药研发的首要步骤，虽然基因组学的发展，大大加速了靶标大分子的寻找过程，因此要求一种方便快速的检测化合物与蛋白结合作用的方法。目前研究化合物与蛋白相互作用的技术主要包括光谱法、高效液相色谱法、平衡透析法、核磁共振等方法。利用光谱技术能检测蛋白的二级结构变化并得到一系列参数，包括结合常数、猝灭常数等，也能得到化合物在蛋白的结合位点信息，但是不能检测出化合物的作用基团；平衡透析法是定量研究蛋白质与小分子结合平衡的一种传统且成熟的膜分离技术，该技术得到的是化合物与蛋白的结合率，但不能得出具体化合物与蛋白的作用机理。核磁共振技术识别分子间相互作用方面有许多优势且得到了广泛应用，针对蛋白的抑制剂的筛选工作，为药物研发提供先导化学物，蛋白质三维结构解析用以辅助药物设计，优化先导化合物；在临床实验阶段，通过磁共振成像对病灶进行监察，对药物的毒性、临床效果等进行评估等。与1h83％天然丰度相比，19f的天然丰度达到100％，比一般氢谱更加灵敏，且氟不存在于天然蛋白质中，干扰信号较弱，因此19f-nmr是研究化合物与蛋白相互作用的有利手段。
利奥西呱是一线的sgc激动剂，于2013年10月获美国fda批准，是第一个也是唯一一个获得批准的用于持续性/复发性或慢性不能手术治疗的慢肺栓塞型肺动脉高血压，同年9月，fda指定利奥西呱为治疗肺动脉高血压和慢肺栓塞型肺动脉高血压的孤儿药，其安全性好，且服用方便，具有良好的市场前景。本发明以利奥西呱与血清蛋白为例，开发检测利奥西呱与蛋白作用的方法，现有技术中未见相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于19f-nmr技术快速检测利奥西呱与蛋白相互作用的方法。
本发明技术方案为：
一种基于19f-nmr技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，包括步骤：
1)将氘代dmso重水按体积比1：2混合，以该溶剂溶解利奥西呱；配制利奥西呱-人血清蛋白摩尔浓度比为1:0,1:0.02,1:0.11,1:0.44,1:0.66,1:1,1:1.33,1:2,1:3的混合溶液，以三氟乙酸定标，检测混合体系19f-nmr谱，调节nmr参数；记录化学位移，利用以下公式计算结合常数和结合位点数：
其中δt是实测化学位移，δc是游离配体化合物化学位移，δb是结合态化合物位移，k为结合常数，f是化合物浓度，b是蛋白浓度，n为结合位点数量；
2)利用华法林和布洛芬为位点竞争试剂判断利奥西呱结合位点，配制摩尔浓度比为1:1的利奥西呱-人血清蛋白溶液，以三氟乙酸定标，在该复合溶液中加入华法林溶液作为位点1竞争试剂，该复合溶液中加入布洛芬溶液作为位点2竞争试剂，检测其结合位点。
根据本发明优选的，步骤1)所述的调节nmr参数为：脉冲程序调至zgf1qn，扫场次数调至8219，采样点数调至131072，空扫次数调至4，谱宽调至89285.711hz，采样时间调至0.7340032sec，增益调至210.38，弛豫时间调至1.00000000sec，脉宽调至17.9usec。
根据本发明优选的，步骤1)所述的dmso在整个体系中的体积含量控制在5％以下。
根据本发明优选的，步骤1)优化了数据处理方式，上述公式中仅δt，f和b三个已知变量，其余δc，δb和n为未知参数，本发明利用matlab数据处理软件拟合出浓度与化学位移相关曲线，调节运算初始值，及其上下限范围，即设置初始估值分别为：k，5000，上下限为1000000和100；δb为-42，上下限为100和-100；n初始值为1，上下限为10和0。
根据本发明进一步优选的，基于19f-nmr技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，具体步骤如下：
1)配制0.01mph7.4pbs溶液，以该溶液溶解浓度依次为6，4，2.67，2，1.32，0.66，0.22，0.04mm的人血清白蛋白各600μl；
2)将氘代dmso重水按体积比1：2混合，以该溶剂溶解利奥西呱，使利奥西呱终浓度为80mm；
3)将80mm浓度利奥西呱精密取40μl加入不同浓度血清蛋白溶液中，使利奥西呱终浓度为2mm，另外在pbs中加入相同体积上述溶液配制为只有利奥西呱的对照溶液，配制成配体蛋白摩尔浓度比为1:0,1:0.02,1:0.11,1:0.44,1:0.66,1:1,1:1.33,1:2,1:3混合溶液；
4)将步骤3)制备的蛋白利奥西呱混合溶液涡旋混匀，于室温下孵育60min，转移至核磁管中，送入核磁谱仪检测，调整nmr参数：脉冲程序调至zgf1qn，扫场次数调至8219，采样点数调至131072，空扫次数调至4，谱宽调至89285.711hz，采样时间调至0.7340032sec，增益调至210.38，弛豫时间调至1.00000000sec，脉宽调至17.9usec；
5)图谱检测完成后，进行傅里叶变换，调整相位，对图谱定标，将-75.58ppm左右的三氟乙酸定位为0ppm，得出未加蛋白时利奥西呱化学位移为-43.03ppm，加入蛋白的利奥西呱向低场位移，说明氟原子与蛋白发生相互作用；
6)根据利奥西呱化学位移和一下公式计算结合常数和结合位点数：
其中δt是实测化学位移，δc是游离配体化合物化学位移，δb是结合态化合物位移，k为结合常数，f是化合物浓度，b是蛋白浓度，n为结合位点数量；根据以上公式用matlab拟合曲线，利用fittingtool中的customequation自定义公式，设置初始估值分别为：k，5000，上下限为1000000和100；δb为-42，上下限为100和-100；n初始值为1，上下限为10和0；
7)在摩尔浓度比为1：1的利奥西呱-人血清白蛋白混合溶液中加入不同浓度华法林和布洛芬，送入核磁谱仪检测，进行傅里叶变换，调整相位，以三氟乙酸定标，得到人血清白蛋白使利奥西呱的信号消失，华法林的加入使利奥西呱信号重新出现，故利奥西呱与华法林结合物位点一致。
有益效果：
1.本发明优化了利奥西呱-人血清白蛋白19f-nmr参数，在研究化合物与蛋白相互作用中，nmr参数优化十分重要，其脉冲程序，采样点数，空扫次数，谱宽，采样时间，增益，弛豫时间等对19f-nmr谱影响很大。利奥西呱氟原子信号较弱，本发明调节了以上参数，使利奥西呱19f信号响应较强，可用于后期研究利奥西呱与其他蛋白作用；
2.本发明优化利奥西呱溶剂比例，利奥西呱溶解性差，在dmso中溶解良好，且dmso能增大化合物溶解度，在一定含量范围内dmso对蛋白结构影响不大，因此本发明将dmso含量控制在5％以下，既增大了利奥西呱溶解度又不影响蛋白结构，可用于后期利用nmr技术检测溶解性差的化合物与蛋白相互作用。
3.本发明优化了拟合化学位移与浓度相关曲线的参数，可用于利奥西呱与其他蛋白相互作用的曲线拟合。
4.本发明发现利奥西呱的f原子与氨基酸残基存在非共价键作用，可见其芳香环上的f原子具有潜在的药理作用，可用于后期利奥西呱构效关系分析。
附图说明
图1为在利奥西呱与人血清白蛋白前后的19f-nmr谱图。
图2为在利奥西呱与人血清白蛋白前后的19f-nmr谱图。
图3为在利奥西呱-人血清白蛋白体系中加入位点竞争试剂的19f-nmr谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
所需仪器：布鲁克avc400m核磁共振谱仪等效仪器或以上，十万分之一天平等效仪器或以上。
试剂：氘代dmso，纯度大于99.5％；氘代水，纯度大于99.5％；磷酸二氢钾，纯度大于98％；磷酸氢二钾，纯度大于98％；华法林，纯度大于99％；布洛芬，纯度大于99％。
所需实验参数：
一种基于19f-nmr技术快速检测化合物与蛋白相互作用的方法，包括步骤：
1)配制0.01mph7.4pbs溶液，以该溶液溶解浓度依次为6，4，2.67，2，1.32，0.66，0.22，0.04mm的人血清白蛋白各600μl；
2)将氘代dmso重水按体积比1：2混合，以该溶剂溶解利奥西呱，使利奥西呱终浓度为80mm；
3)将80mm浓度利奥西呱精密取40μl加入不同浓度血清蛋白溶液中，使利奥西呱终浓度为2mm，另外在pbs中加入相同体积上述溶液配制为只有利奥西呱的对照溶液，配制成配体蛋白摩尔浓度比为1:0,1:0.02,1:0.11,1:0.44,1:0.66,1:1,1:1.33,1:2,1:3混合溶液；
4)将步骤3)制备的蛋白利奥西呱混合溶液涡旋混匀，于室温下孵育60min，转移至核磁管中，送入核磁谱仪检测，调整nmr参数：脉冲程序调至zgf1qn，扫场次数调至8219，采样点数调至131072，空扫次数调至4，谱宽调至89285.711hz，采样时间调至0.7340032sec，增益调至210.38，弛豫时间调至1.00000000sec，脉宽调至17.9usec；
5)图谱检测完成后，进行傅里叶变换，调整相位，对图谱定标，将-75.58ppm左右的三氟乙酸定位为0ppm，得出未加蛋白时利奥西呱化学位移为-43.03ppm，加入蛋白的利奥西呱向低场位移，说明氟原子与蛋白发生相互作用；
6)根据利奥西呱化学位移和一下公式计算结合常数和结合位点数：
其中δt是实测化学位移，δc是游离配体化合物化学位移，δb是结合态化合物位移，k为结合常数，f是化合物浓度，b是蛋白浓度，n为结合位点数量；根据以上公式用matlab拟合曲线，利用fittingtool中的customequation自定义公式，设置初始估值分别为：k，5000，上下限为1000000和100；δb为-42，上下限为100和-100；n初始值为1，上下限为10和0；
7)在摩尔浓度比为1：1的利奥西呱-人血清白蛋白混合溶液中加入不同浓度华法林和布洛芬，送入核磁谱仪检测，进行傅里叶变换，调整相位，以三氟乙酸定标，得到人血清白蛋白使利奥西呱的信号消失，华法林的加入使利奥西呱信号重新出现，故利奥西呱与华法林结合物位点一致。