检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒及方法与流程

本发明属于生物标志物检测领域，尤其涉及一种检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒及方法。

背景技术：

糖尿病肾病是糖尿病最严重的慢性微血管并发症之一，并最终引起终末肾衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因。然而，糖尿病肾病早期很难发现，且临床糖尿病肾病诊断黄金标准肌酐和蛋白尿也只能间接反映肾脏实质性病变，在正常蛋白尿期间无法诊断早期糖尿病肾病。通常当临床确诊时，糖尿病肾病患者错过了最佳的治疗时机，致使疾病急剧恶化，不可逆转。因此，针对糖尿病肾病早期损伤生物标志物早发现、早干预，具有重要的现实意义。

目前研究发现了许多早期糖尿病肾病相关的生物标志物，有些生物标志物可以在此阶段释放到尿液中，尿液中的蛋白种类及含量的高低直接反映了泌尿系统，尤其是肾脏的健康状态，可以预测糖尿病肾病发生、发展及预后的情况。比如足糖萼蛋白(podocalyxin)，是足细胞损伤的早期生物标志物，并与疾病的发展正相关；ⅳ型胶原蛋白(collagenⅳ)，在维持细胞基底膜正确装配方面具有重要的作用；肾病蛋白(nephrin)，在裂空隔膜的装配中发挥重要的作用；肝型脂肪酸结合蛋白(l-fabp)，是肾小球间质细胞损伤的生物标志物，可以预测糖尿病肾病的发生；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)、胱抑素c(cystatinc)、神经生长因子-1(netrin-1)是肾小管近端损伤的生物标志物。对这些与疾病发生发展密切相关的生物标志物进行检测，有助于了解糖尿病肾病发生和发展，有效提高对肾病并发症的预测能力。

目前检测早期糖尿病肾病的检测设备中常用的方法是采用酶联免疫技术(elisa)，其技术缺点如下：检测设备体积大、成本高；检测时间长、重复性不好，不适合临床的快速筛查。然而，目前尚无利用多种生物标志物同时进行定量检测的设备，因此不能实现同时定量检测早期糖尿病肾病的多种生物标志物，从而无法为早期糖尿病肾病临床诊断提供依据。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒，旨在解决目前检测设备无法同时定量检测早期糖尿病肾病多种生物标志物的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒，所述胶体金试剂盒包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及支撑垫，其中，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫首尾相互重叠一段预设长度，所述硝酸纤维素膜上依次设置第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条、第四检测试剂条以及捕获试剂条，其中：

所述样品垫包括ⅳ型胶原蛋白标准品、足糖萼蛋白标准品、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品和肝型脂肪酸结合蛋白标准品；

所述金标垫上包被有ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、足糖萼蛋白单克隆抗体、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体和肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；

所述第一检测试剂条包被有抗ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，所述第二检测试剂条包被有抗足糖萼蛋白单克隆抗体，所述第三检测试剂条包被有抗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体，所述第四检测试剂条包被有抗肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；

所述捕获试剂条包被有与所述金标垫上包被的单克隆抗体结合的二抗。

优选的，所述第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条、第四检测试剂条和捕获试剂条还包括有用于定量生物样品液体的生物标志物的指示剂。

优选的，所述指示剂为酶、辅基、荧光物质、生物发光物质或放射活性物质。

优选的，所述第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条、第四检测试剂条设置在所述硝酸纤维素膜的排列顺序是沿着样品垫上的样品层析方向并按照生物标志物分子量从大到小平行等间隔排列。

优选的，所述预设长度为1.5～2mm，所述二抗为羊抗鼠igg或兔抗鼠igg。

优选的，所述样品垫和金标垫均采用玻璃纤维膜或聚酯膜材料制成。

优选的，所述支撑垫为一种硬质塑料底板或pvc支撑底板。

优选的，所述吸水垫采用吸水能力的吸水纤维或吸水海绵材料制成，用于吸附并引流所述金标垫上的生物样品液体，使生物样品液体通过所述金标垫将金标抗体复合物沿着样品液体的层析方向吸附至所述硝酸纤维素膜上相应的检测试剂条位置或捕获试剂条的位置。

本发明还提供一种使用胶体金试剂盒检测糖尿病肾病生物标志物的方法，该方法包括如下步骤：从受试者获得尿液作为生物样品液体；将生物样品液体倒入金标垫的加样位置处；生物样品液体的生物标志物与金标垫上的相应抗体结合形成胶体金抗体复合物；胶体金抗体复合物随着样品液体在硝酸纤维膜上层析流动，被第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条、第四检测试剂条上的单克隆抗体结合；判断捕获试剂条上的颜色是否发生变化；如果捕获试剂条上的颜色发生变化，则将第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条和第四检测试剂条的颜色与样品垫的标准品颜色进行比较得出生物标志物的含量。

优选的，所述的检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒的检测方法还包括如下步骤：如果捕获试剂条上的颜色发生变化，则确定胶体金试剂盒的第一检测试剂条、第二检测试剂条、第三检测试剂条、第四检测试剂条已失效。

相较于现有技术，本发明所述检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒采用上述技术方案，达到如下技术效果：可以针对早期糖尿病肾病的多种早期生物标志物进行检测，解决单一生物标志物筛查谱狭窄及预见性较差的问题，可以节省检测成本，提高检测准确性。此外，所述胶体金试剂盒可以结合定量检测仪一起使用实现多种生物标志物的同时定量检测，为早期糖尿病肾病临床诊断提供依据，提高检测效率。

附图说明

图1是本发明检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒较佳实施例的结构示意图；

图2是使用本发明胶体金试剂盒检测糖尿病肾病生物标志物的方法较佳实施例的流程示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成上述目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，本发明检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒适合检测以下四种生物标志物，通过检测这四种生物标志物的含量，为糖尿病肾病早期诊断提供辅助。

足糖萼蛋白(podocalyxin)是o连接的跨膜糖蛋白，位于肾脏足细胞足突顶膜区，是肾小球基底膜电荷屏障的主要成分，保证肾小球滤过膜电荷屏障的完整性，在肾脏滤过功能中发挥着重要作用。

ⅳ型胶原蛋白(collagenⅳ)是肾小球基底膜及系膜基质的重要组称成分，在肾小球基底膜滤过完整性中发挥着重要作用。糖尿病人高血糖刺激产生ⅳcollagen，若增加的ⅳcollagen沉积到糖尿病人肾脏肾小球系膜基质上，会产生弥散性肾小球硬化症；若沉积到肾小球基底膜或肾小管上，会导致系膜扩增、肾小球间质化和肾小管损伤。

肝型脂肪酸结合蛋白(l-fabp)在肾近端小管细胞内表达，参与肾小管间质细胞能量产生及代谢过程。在糖尿病肾病并发过程中，尿液中l-fabp表达水平与尿白蛋白浓度成正相关，预示着尿液中l-fabp是肾小管间质细胞损伤的生物标志物。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)是一种铁离子结合蛋白，在肾小管内皮细胞中表达，参与多种生物学功能，如细胞凋亡、天然免疫、肾脏生长发育等。在糖尿病肾病早期，ngal在尿液中出现高表达，且ngal表达量的增加与肾小管近端小管的损伤呈正比，预示着尿液中ngal是肾小管间质细胞损伤的生物标志物。

如图1所示，图1是本发明检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒较佳实施例的结构示意图。在本实施例中，所述胶体金试剂盒包括样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4以及支撑垫5。其中，所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4首尾相互重叠一段预设长度(例如1.5～2mm)并粘贴在所述支撑垫5上。所述样品垫1包括足糖萼蛋白标准品、ⅳ型胶原蛋白标准品、肝型脂肪酸结合蛋白标准品和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。

所述金标垫2上包被所述金标垫上包被有ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、足糖萼蛋白单克隆抗体、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体和肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体；

所述硝酸纤维素膜3上依次设置有第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34以及捕获试剂条35。在本实施例中，所述第一检测试剂条31包被有抗ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，所述第二检测试剂条32包被有抗足糖萼蛋白单克隆抗体，所述第三检测试剂条33包被有抗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体，所述第四检测试剂条34包被有抗肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。所述捕获试剂条35包被的抗体为与金标垫2上包被的单克隆抗体结合的二抗，例如，羊抗鼠igg或兔抗鼠igg。第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34以及捕获试剂条35还包括有用于定量生物样品液体的生物标志物的指示剂，例如酶、辅基、荧光物质、生物发光物质或放射活性物质。本发明实施例中所使用的包被一词意为非特异性吸附固定意思，本发明实施例所使用的四种单克隆抗体和试剂等材料除特别说明外，均为普通市售材料。

在本实施例中，所述第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34在所述硝酸纤维素膜3的设置排列顺序为沿着样品垫1上的样品层析方向6并按照生物标志物分子量从大到小平行等间隔排列。例如，足糖萼蛋白(podocalyxin)、ⅳ型胶原蛋白(collagenⅳ)、肝型脂肪酸结合蛋白(l-fabp)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)，按照分子量依次大约为55kda、160kda、14kda、21kda，因此，硝酸纤维素膜3上依次设置有第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33和第四检测试剂条34分别包被的抗单克隆抗体从左到右依次为抗ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体、抗足糖萼蛋白单克隆抗体、抗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体、抗肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

在本实施例中，所述样品垫1和金标垫2均采用玻璃纤维膜或聚酯膜材料制成。所述金标垫2上标记有针对生物标志物的单克隆抗体。所述第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34上包被的抗体分别与金标垫2包被的抗体相互配对单克隆抗体。所述捕获试剂条32包被的抗体为一种能和金标垫2上标记的单克隆抗体结合的二抗，例如，羊抗鼠igg或兔抗鼠igg。所述样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4首尾相互重叠预设长度(例如1.5～2mm)并粘贴在所述支撑垫5上。所述吸水垫4采用吸水能力强的吸水纤维或吸水海绵材料制成，能够对所述样品垫1上的样品液体具有强吸引流作用，即样品液体通过所述金标垫2将金标抗体-抗原复合物或者金标抗体复合物沿着样品液体的层析方向6吸附至所述硝酸纤维素膜3上相应的检测试剂条位置或捕获试剂条位置。所述支撑垫5为一种硬质塑料底板或pvc支撑底板。

如图2所示，图2是使用本发明胶体金试剂盒检测糖尿病肾病生物标志物的方法较佳实施例的流程示意图。

步骤s21，从受试者获得尿液作为生物样品液体；在使用本发明利用述胶体金试剂盒检测糖尿病肾病患者的生物标志物时，检测者从受试者获取糖尿病肾病患者的尿液作为生物样品液体。

步骤s22，将生物样品液体倒入金标垫2的加样位置处；检测者将受试者的生物样品液体倒入金标垫2的加样位置处。

步骤s23，生物样品液体的生物标志物与金标垫2上的相应抗体结合形成胶体金抗体复合物；受试者的尿液流经金标垫2，患者尿液中早期糖尿病肾病相关的生物标志物与金标垫2上的相应抗体结合，形成胶体金抗体复合物，即抗原抗体免疫复合物。

步骤s24，胶体金抗体复合物随着样品液体在硝酸纤维膜3上层析流动，被第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34上的单克隆抗体结合；胶体金抗体复合物随着样品液体在硝酸纤维膜3上层析流动，当层析到检测试剂条区域时，则被预先包被有标志物的单克隆抗体捕获截留在第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34上，当捕获的某种标志物越多，在某一条检测试剂条上颜色越深。

步骤s25，捕获试剂条35上的颜色是否发生变化；检测者目测捕获试剂条上的颜色是否发生变化。如果捕获试剂条35上的颜色发生变化，执行步骤s26；如果捕获试剂条35上的颜色没有发生变化，执行步骤s27。在层析过程中，未被第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33和第四检测试剂条34截留的胶体金抗体复合物继续前行，当到达捕获试剂条35区域，则会被预先包被的二抗(例如羊抗鼠igg)识别并截留在捕获试剂条35上，显示红色。

步骤s26，将第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33和第四检测试剂条34的颜色与样品垫的标准品颜色比较得出生物标志物的含量。测试者根据不同检测试剂条上红色的深浅来判断样品中的不同标志物的含量。如果样品中没有含有某种标志物，则在相应的检测试剂条上不呈现颜色，如果含有某种标志物，就会在相应的检测试剂条上呈现不同深浅程度的红色。

步骤s27，确定胶体金试剂盒的各种检测试剂条失效。如果含有某种标志物，就会在相应的检测试剂条上呈现不同深浅程度的红色。捕获试剂条35上如果没有红色条带出现，则说明胶体金试剂盒的试剂失效。

在使用本发明利用述胶体金试剂盒检测早期糖尿病肾病患者的尿液(生物样品液体)时，患者尿液中早期糖尿病肾病相关的生物标志物与金标垫2上的相应抗体结合，形成胶体金抗体复合物(即抗原抗体免疫复合物)；该复合物随着样品液体在硝酸纤维膜3上层析流动。当层析到检测试剂条区域时，则被预先包被有标志物的单克隆抗体捕获截留在第一检测试剂条31、第二检测试剂条32、第三检测试剂条33、第四检测试剂条34上，捕获的某种标志物越多，在某一条检测试剂条上颜色越深；同时，在层析过程中，未被截留的胶体金抗体复合物继续前行，当到达捕获试剂条35区域，则会被预先包被的二抗(例如羊抗鼠igg)识别并截留在捕获试剂条35上，显示红色。根据不同检测试剂条31上红色的深浅来判断样品中的不同标志物的含量。如果样品中不含有某种标志物，则在相应的检测试剂条上不呈现颜色，如果含有某种标志物，就会在相应的检测试剂条上呈现不同深浅程度的红色。捕获试剂条35上如果没有红色条带出现，则说明胶体金试剂盒的试剂失效。本发明所述胶体金试剂盒具有检测容易、应用广泛、携带方便、筛查全面的优点，并可以与颜色采集设备结合实现多种标志物的同时定量检测，提高检测效率。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效功能变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。