一种细胞色素c检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测领域，涉及一种细胞色素c检测方法及试剂盒。

背景技术

细胞色素c由铁、蛋白质和卟啉构成，是线粒体呼吸链的重要组成和指示细胞凋亡的标志物。此外，细胞色素c还有许多其他重要的作用，例如协助微生物将胞内氧化有机物产生的电子转移至难溶性金属(氢)氧化物和固体电极。

传统细胞色素c检测方法，如血红素染色和蛋白质印迹，具有可视化和定量的优势，但是它们的灵敏度低和检测过程复杂。光谱法虽然简单易用，但仅限于定性监测细胞色素c的氧化还原状态。电化学技术由于其简单的操作、高灵敏度和定量分析的优点，被应用于细胞色素c的检测。然而，电化学技术依赖于昂贵的酶或金属纳米粒子进行信号放大。此外，由于它们在电极/溶液界面处的电子转移速率较低，需要复杂繁琐的电极预处理和修饰过程。为了克服这些不足，需要发展一些细胞色素c检测的新方法，例如探索细胞色素c可能存在的生物活性，通过检测其底物分子而实现对细胞色素c的检测。有研究表明，细胞色素c的血红素辅基在结构上与过氧化物酶的相似(均含有与卟啉配位的fe(iii)和一个或两个轴向配体)，因而具有类过氧化物酶活性。实际上，血红素的类过氧化物酶活性已被应用于凝胶染色和比色检测的显色反应。这些检测方法的显色反应需要使用一种具有氧化还原活性的底物分子，名为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)。研究表明四甲基联苯胺具有可逆的电化学活性。目前还没有报道利用细胞色素c的过氧化氢酶活性进行原位电化学检测。因此，可以开发出一种新型的微生物细胞色素c原位快速检测方法具有重大意义。

技术实现要素：

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于将细胞色素c固有的过氧化物酶活性与丝网印刷碳电极检测技术相结合，构建一种原位的细胞色素c检测方法。该方法具有特异性高，操作简单，检测迅速的优点。

本发明的目的在于提供一种细胞色素c检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种细胞色素c检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测细胞色素c的试剂盒，由洗涤缓冲液、丝网印刷碳电极、过氧化氢溶液、检测

缓冲液和四甲基联苯胺粉末制成。

进一步的，所述的洗涤缓冲液是0.01m～0.03m、ph5.4～9.4的磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述的检测缓冲液是0.1m～0.3m、ph3.0～7.0的磷酸柠檬酸缓冲液。

一种检测细胞色素c的检测方法，包含以下步骤：

1)将待测微生物细胞液滴加到丝网印刷碳电极的工作电极表面，干燥，制成微生物修饰的丝网印刷碳电极；

2)将四甲基联苯胺溶液滴加到微生物修饰的丝网印刷碳电极，反应至11分钟时，用仪器进行电化学反应检测，检测其产生的电流强度；

3)根据电流强度分析判断待测细胞中是否含有细胞色素c。

进一步的，步骤1)所述的微生物细胞液由微生物细胞和pbs缓冲液组成。

进一步的，步骤1)所述的干燥温度为18～27℃。

进一步的，步骤1)所述的干燥时间为60～120min。

进一步的，步骤2)所述仪器为电化学工作站。

进一步的，步骤2)中，进行电化学反应检测的电压为-0.30v～-0.10v。

进一步的，步骤3)中所述四甲基联苯胺溶液含有0.05～0.2mg/ml四甲基联苯胺，1～10％v/v无水乙醇，0.3～0.7mmh2o2，30～70％v/vpbs缓冲液，余量为水。

进一步的，所述四甲基联苯胺溶液的用量为30～70ul。

进一步的，根据电流强度分析判断待测细胞中是否含有细胞色素c的具体方法为：观察开始检测后的第10秒处的电流强度值，若电流强度值在-0.23μa以上，说明此样品中含有细胞色素c。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所述的细胞色素c检测方法具有原位的优点，无需任何破坏性样品制备过程；

(2)细胞色素c具有过氧化物酶活性，在过氧化氢存在下能够催化氧化四甲基联苯胺，氧化产物在丝网印刷碳电极表面可以被直接还原，从而达到原位检测目的；

(3)本发明所述的细胞色素c检测方法具有较高的灵敏度，对模式分析物希瓦氏菌s.oneidensismr-1细胞色素c检测限为40.78fmol，检测过程方便、迅速，可用于实地现场检测。

附图说明

图1为原位检测细胞色素c的示意图；

图2(a)和(b)为微生物修饰丝网印刷碳电极的扫描电镜图；(c)和(d)为荧光显微电镜图；(e)为时间-电流曲线图；

图3(a)为细胞色素c过氧化物酶活性检测；(b)为循环伏安图；

图4为过氧化氢工作浓度的优化图；

图5为细胞色素c氧化四甲基联苯胺反应时间的优化图；

图6(a)为细胞色素c检测的回归曲线；(b)为细胞色素c检测的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：微生物修饰丝网碳电极的制备

将微生物与培养液以1:100比例接种于500ml三角锥形瓶中，在温度为30℃、转速180rpm的恒温摇床中振荡培养16h。取出培养菌液，后以5000g离心5min，收集沉淀，以pbs(磷酸缓冲液，0.02m、ph为6)洗涤3遍后，用pbs将沉淀重新悬浮。将7ul微生物细胞悬液滴加至丝网印刷碳电极的工作电极表面，室温(18～27℃)干燥60-120min，使微生物细胞结合到工作电极表面。

为了验证微生物细胞是否修饰丝网印刷碳电极表面，本发明进行了扫描电镜表征，结果显示修饰前的丝网印刷碳电极表面较为平整，无杆状的菌体(见图2(a))；而修饰微生物的丝网印刷碳电极表面可看到有杆状的微生物细胞(见图2(b))，说明本发明滴涂法确实可以将微生物细胞修饰至碳电极表面。

其次，为了验证修饰至丝网印刷碳电极表面的微生物的活性，用live/dead^tmbaclight^tm细菌活力检测试剂盒对碳电极进行染色。将染色的微生物修饰的丝网印刷碳电极进行荧光显微镜观察分析，有大量杆状微生物呈现绿色荧光，说明微生物膜细胞完好，是活细胞(见图2(c))。图2(d)只观察到少量的红色杆状物，是一些已经死亡或将要死亡的细胞，进一步统计发现有4.35％的细菌细胞为死菌。这些结果说明滴涂法制备的微生物修饰丝网印刷碳电极具有较高细胞活性。

以四甲基联苯胺显色实验检测微生物细胞色素c是否具有过氧化物酶活性。如图3(a)所示，模式微生物希瓦氏菌s.oneidensismr-1呈粉红色(离心管a)，表明其含有较高的细胞色素c。将浓度为5.0×10⁸cfu/ml的s.oneidensismr-1菌液加入到四甲基联苯胺溶液后，无色的四甲基联苯胺溶液变成了蓝色(离心管b)。加入h2so4后终止，发现蓝色溶液变成黄色溶液(离心管c)。通过使用循环伏安法，结果如图3(b)所示。当在缓冲溶液中测量时，微生物修饰的丝网印刷碳电极(红色虚线)和裸丝网印刷碳电极(黑色虚线)都是没有电流信号；然而，当在四甲基联苯胺溶液中测试时，微生物修饰的丝网印刷碳电极(红色实线)的还原峰值电流高于裸丝网印刷碳电极(黑色实线)，证明了微生物细胞色素c含有过氧化物酶活性。

为证实检测方法的可行性，将四甲基联苯胺溶液滴加至微生物修饰的丝网印刷碳电极和裸丝网印刷碳电极表面，设置电位为-0.20v，进行计时电流法试验。该电位是通过分析循环伏安图(见图3(b))确定，其中观察到还原电流峰值电位为0.056v。更负的电位(例如-0.20v)将提供更好的检测性能，因为它可以充分还原氧化的四甲基联苯胺以产生更强的响应电流信号。结果如图2(e)所示，微生物修饰的丝网印刷碳电极(红线)呈现显著的还原电流，而没有细菌修饰的裸丝网印刷碳电极(灰线)仅呈现弱背景信号。只有微生物存在时才能产生响应电流信号，说明本检测方法是可行的。

实施例2：原位检测微生物细胞色素c

原位检测细胞色素c的方法的示意图如图1所示，具体操作步骤为：

1)将7ul待测的微生物细胞液滴加至丝网印刷碳电极的工作电极表面，室温(18～27℃)干燥60-120min，使微生物细胞结合到工作电极表面，得微生物修饰的丝网印刷碳电极；

2)将制备的微生物修饰的丝网印刷碳电极连接至chi660d型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，中国)，在电化学工作站操作软件选择检测模式为时间-电流曲线模式，设置电压为-0.20v；

3)配四甲基联苯胺溶液，含有0.2mg/ml四甲基联苯胺，10％v/v无水乙醇，0.7mmh2o2，70％v/v(pbs)磷酸缓冲液，余量为水；

4)将四甲基联苯胺溶液滴加到2)中的微生物修饰的丝网印刷碳电极，使其充分反应；

5)反应至11分钟时，用电化学工作站进行电化学反应检测，检测其在时间-电流曲线第10秒处电流强度值，若电流强度值在-0.23μa以上，说明此样品中含有细胞色素c。

实施例3：原位检测微生物细胞色素c

原位检测细胞色素c的方法的示意图如图1所示，具体操作步骤为：

1)将7ul待测的微生物细胞液滴加至丝网印刷碳电极的工作电极表面，室温(18～27℃)干燥60-120min，使微生物细胞结合到工作电极表面，得微生物修饰的丝网印刷碳电极；

2)将制备的微生物修饰的丝网印刷碳电极连接至chi660d型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，中国)，在电化学工作站操作软件选择检测模式为时间-电流曲线模式，设置电压为-0.20v；

3)配四甲基联苯胺溶液，含有0.05mg/ml四甲基联苯胺，1％v/v无水乙醇，0.3mmh2o2，30％v/v(pbs)磷酸缓冲液，余量为水；

4)将四甲基联苯胺溶液滴加到2)中的微生物修饰的丝网印刷碳电极，使其充分反应；

5)反应至11分钟时，用电化学工作站进行电化学反应检测，检测其在时间-电流曲线第10秒处电流强度值，若电流强度值在-0.23μa以上，说明此样品中含有细胞色素c。

实施例4：细胞色素c检测方法的条件优化

为了获得最佳的检测效果，本实施例对影响检测效果的参数(过氧化氢浓度和反应时间)作进一步的优化。

本发明的检测方法利用细胞色素c过氧化氢酶活性进行tmb的催化氧化，而细胞色素c的过氧化物酶活性依赖于过氧化氢的浓度。用希瓦氏菌s.oneidensismr-13.575×10⁹cfu/ml作为模式分析物，设置了5个不同过氧化氢浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mm)，考察不同浓度过氧化氢对检测信号的影响。结果如图4所示，随着过氧化氢浓度从0.1mm增加到0.5mm，响应电流信号迅速增加。当过氧化氢浓度从0.5mm增加到0.9mm，电流信号逐渐降低。过氧化氢浓度为0.5mm时，响应电流信号最大。因此，0.5mm是最佳的过氧化氢浓度。

本检测方法依赖于细胞色素c的过氧化物酶活性，因此其检测性能受细胞色素c催化的tmb氧化反应时间的影响。以3.575×10⁹cfu/ml的希瓦氏菌s.oneidensismr-1为分析物，过氧化氢浓度为0.5mm，设置了6个不同反应时间(3、5、7、9、11、13min)，检测不同酶促反应时间下的响应信号。结果如图5所示，电流响应信号与酶促反应时间的存在依赖关系，随着酶反应时间从3min增加到11min，响应电流逐渐增加。当酶反应达到11min时，观察到最大电流信号。进一步增加到13min的酶反应时间，响应电流信号有所减缓，说明细胞色素c催化的tmb氧化反应达到了平衡。因此，11min是最佳的酶反应时间。

实施例5:原位检测微生物细胞色素c的最优方案

根据上述对各参数的优化，可获得最优的原位检测细胞色素c的方法，包括以下操作步骤：

1)将7ul待测的微生物细胞悬液滴加至丝网印刷碳电极的工作电极表面，室温(18～27℃)干燥100min，制成微生物修饰的丝网印刷碳电极；

2)将制备的微生物修饰的丝网印刷碳电极连接至chi660d型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，中国)，在电化学工作站操作软件选择检测模式为时间-电流曲线模式，设置电压为-0.20v；

3)配四甲基联苯胺溶液，其中含有0.1mg/ml四甲基联苯胺，5％v/v无水乙醇，0.5mmh2o2，50％v/vpbs缓冲液，余量为水；

4)将四甲基联苯胺溶液滴加到2)中的微生物修饰的丝网印刷碳电极，使其充分反应；

5)反应至11分钟时，在电化学工作站开始电化学检测，检测其在时间-电流曲线第10秒处电流强度值，若电流强度值在-0.23μa以上，说明此样品中含有细胞色素c。

下面对本发明的细胞色素c检测方法及检测试剂盒作进一步的效果评估。

实施例6:灵敏度检测

以本发明的方法检测含有不同细胞浓度的模式菌株s.oneidensismr-1样品的电流强度值。通过光谱法定量测定s.oneidensismr-1的细胞色素c含量为2.70×10^-19mole/cell。将检测样品细胞浓度换算成细胞色素c含量，为51.70fmol-6.64pmol(结果见图6(a))。以细胞色素c含量的对数值为横坐标，电流强度值作为纵坐标，绘制曲线见图6(b)，分析该曲线可知，其回归方程为i＝-1.956c+2.757，(r²＝0.990)，本发明方法检测限为40.78fmol(根据信号噪音比等于3判断)，线性检测范围为51.7fmol～6.64pmol。为与其他检测方法相比较，根据在检测时使用的四甲基联苯胺溶液体积为50微升，将本发明的检测限40.78fmol转化为细胞色素c浓度为0.816nm。

实施例7:可重复性和稳定性检测

本发明进行了5次独立的检测实验，检测结果均显示出类似的电流强度值，其相对标准偏差为4.57％，说明本发明方法具有很好的可重复性。将微生物修饰的丝网印刷碳电极置于4℃低温储存以研究其稳定性，当储存7天时，微生物修饰的丝网印刷碳电极仍然保留了92％的响应电流，这表明所本方法修饰的丝网印刷碳具有较好的稳定性。

实施例8:通用性检测

将浓度为5.0×10⁸cfu/ml的细菌：绿脓杆菌p.aeruginosa和丛毛单胞菌c.guandongensis分别修饰在丝网印刷碳电极工作电极上。p.aeruginosa和c.guandongensis的细胞色素c含量分别为2.295×10^-20和3.593×10^-20mole/cell。该检测结果与还原(连二亚硫酸盐)-氧化(空气)光谱法检测基本一致，其中p.aeruginosa和c.guandongensis的细胞色素c为1.841×10^-20和2.743×10^-20mole/cell。这些结果表明，建立的方法可普遍用于检测微生物的细胞色素c。

跟电化学免疫传感器法、适配体生物传感器和荧光检测方法(最低检测限分别为30nm、20nm、15nm)相比较，本发明方法具有更好的检测性能、具有较高的灵敏度，检测限为0.816nm，检测过程简单、快速，可用于微生物、动物细胞和人类细胞含有的细胞色素c原位检测。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。