区分小细胞肺癌细胞与正常肺部细胞的生物标志物的制作方法

本发明涉及用于评估小细胞肺癌疾病的新生物标记物,所述生物标记物对肺癌病理学改变较敏感,特别是在疾病或损伤早期阶段。此外,本发明涉及用于评估人患肺癌的风险。

背景技术：

肺癌是目前全球发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，严重威胁人类的身体健康。肺癌按病理学特征分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)。小细胞肺癌属于未分化癌，其病理类型包括燕麦细胞型、中间细胞型和复合燕麦细胞型，小细胞肺癌恶性程度较高，生物学行为恶劣，预后凶险。

生物胺是由氨基酸在脱羧酶的作用下脱羧形成的具有生物活性的低分子量含氮碱性化合物，可看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，根据其组成成分，生物胺主要分为多胺类和单胺类化合物。多胺合成是由精氨酸在一系列酶的催化作用下完成。精氨酸在精氨酸酶的作用下转化为鸟氨酸，后者在鸟氨酸脱羧酶(ornithinedecarboxylase，odc)的催化下脱羧形成腐胺，腐胺再在精脒合成酶和精胺合成酶的催化下，依次转化为精脒和精胺。单胺类物质主要包括儿茶酚胺和杂环胺类神经递质。儿茶酚胺的合成是从酪氨酸主动转运到突触前膜神经末梢内开始的，胞浆内的酪氨酸经两次反应转化为多巴胺，多巴胺然后被转移到储存囊泡中，经β羟化酶转化为去甲肾上腺素，然后大部分的去甲肾上腺素经苯乙醇胺氮位甲基转移酶催化形成肾上腺素。

现代研究表明，内源性小分子生物胺类化合物与癌症的发生密切相关。国内外研究表明乳腺癌、直肠癌、肺癌和肝癌患者体内多胺水平高于正常人群及非肿瘤患者体内多胺水平。儿茶酚胺类神经递质在信号传导过程中起着重要的作用，嗜铬细胞瘤、副神经节瘤等都会导致儿茶酚胺类物质的代谢异常，因此在肺癌的发生发展过程中这类神经递质可能也会发生代谢异常。色氨酸作为5-ht、褪黑素和犬尿酸的代谢前体，在神经免疫调节过程中发挥着重要作用，而免疫调节与肿瘤的发生关系密切。组胺参与体内的炎症反应，研究表明，炎症不仅可能会促发肿瘤疾病，还可能与肿瘤发展的多个环节相关，包括肿瘤细胞形成、进展、逃逸、增生、浸润、血管生成、转移等。

技术实现要素：

建立了一种测定肺成纤维细胞(mrc-5)内鸟氨酸、1,3-丙二胺、尸胺、腐胺、乙酰化腐胺、精脒、乙酰化精脒、二乙酰化精脒、精胺、乙酰化精胺、二乙酰化精胺、酪氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、色氨酸和组胺等17种生物胺含量的hilic-uhplc-ms/ms方法。应用已建立方法测定了人肺成纤维细胞(mrc-5)与小细胞肺癌细胞(nci-h446)中17种生物胺的含量，可实现对肺癌细胞与正常肺细胞之间的区分，并通过独立样本t-检验和roc分析筛选出了13种肺腺癌标记物。可以将小细胞肺癌患者与健康人区分开来。

附图说明

图1为利用spss19.0软件对以上采用上述方法对17种生物胺进行含量测定的结果进行系统聚类分析，所得到的树状图。

具体实施方式

实施例1：

细胞收集

将生长到80％融合度的mrc-5细胞和小细胞肺癌细胞(nci-h446)用预热到37℃的0.25％的胰蛋白酶消化2min左右(在显微镜下观察细胞变圆回缩即表示消化完全)，立即弃去胰酶，用pbs缓冲液将细胞分别收集在离心桶中，离心(1500rpm/min,4℃,5min)，再用pbs洗一遍，最后用pbs重悬细胞，取20μl稀释5倍，计数，将细胞悬液完全转移到1.5mlep管中，离心去除(2000rpm/min,4℃,5min)，细胞饼立即加入500μl淬灭剂和蛋白沉淀剂，涡旋30s，使细胞充分与其接触，冻入-80℃冰箱备用。

样品预处理

将上述样品从-80℃冰箱取出，加入10μl内标溶液，50hz超声溶解3min,再冻入-80℃冰箱中，冻融三次，涡旋3min，离心5min，取上清液，于n2流下吹干，100μl初始流动相复溶，取2μl进样。

试剂

甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，均为美国fisher公司产品，三氟乙酸美国sigma公司，甲酸为色谱纯，水为去离子重蒸水。

仪器

prominenceuflcxr型超快速高分离液相色谱仪配有lc一20ad输液泵；sil一20ac自动进样器；

cto一20ac柱温箱和dgu一20a3脱气机(日本岛津株式会社)；ap工4000型三重四极杆串联质谱仪(美国absc工ex公司)和analystl.v1.6数据处理系统；ab135一s电子天平(瑞士梅特勒一托利多仪器有限公司)；超声波发生器(浙江象山石浦海天电子仪器厂)；

mtn-2800d型氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；sw-cj-1d单人单面垂直送风(经济型)净化工作台(苏州智净净化工作台)；无菌培养箱(德国thermoscientific公司)；电子显微镜(leica公司)；细胞计数板(thermoscientific公司)

色谱条件

色谱柱：venusilhilicc18(100mm×2.1mm,3.0μm)天津agela科技公司

流动相：a:5mm乙酸铵-0.2％甲酸水溶液b:0.2％甲酸乙腈溶液

梯度洗脱程序如表1所示：

表1uhplc梯度程序

流速：0.4ml.min-1

进样量：2μl

柱温：30℃

质谱条件

离子源为电喷雾电离源(esi源)，正离子方式检测；源温度500℃；离子喷雾电压5500v；真空度(10e-5)3.1torr；氮气作为雾化气1、雾化气2与气帘气流速分别为50、40与20psi；扫描方式为多反应离子监测模式(mrm)

将两种细胞样品按上述方法处理，采用上述方法对17种生物胺进行含量测定，得到结果如下表所示。

通过独立样本t-检验和roc曲线分析，nci-h446细胞分别得到13个差异性标记物，这些标记物可作为抗癌药物的筛选的评价指标，从而为抗癌药物的临床试验提供坚实的理论依据。

与正常细胞相比，在nci-h446内，原形多胺和单乙酰化多胺orn,dap,put,nput,spd,nspd,spm和nspm显著性升高。