本发明属于电化学生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于三链连环dna的电化学生物传感器及制备方法。
背景技术：
微小rna（mirna）是一类小的内源性非编码rna，其大约由22-25个核苷酸组成，能够通过翻译抑制，mrna降解和蛋白质合成抑制等负调节基因表达。研究表明，mirna在多种生物过程中起着重要的调节作用，如过敏性疾病，造血分化，心血管疾病和癌症。此外，已经证明，mirna可被释放到体液内的循环中，可以以非常稳定的形式在血清或血浆中检测到。mirna-21在宫颈癌，结肠癌，非小细胞肺癌，化脓性汗腺炎和卵巢癌中显着上调，因此开发一种简单可靠，灵敏检测mirna的方法对临床癌症的诊断，治疗和预后非常有意义。
基于mirna在疾病诊断和预后中的重要性，迫切需要找到灵敏可靠的检测mirna的方法。为了实现对mirna高灵敏检测，许多课题组已经做了大量的工作，包括基于微阵列的技术，荧光，northern印迹和定量逆转录聚合酶链式反应（rtpcr）等。尽管这些方法实现了对mirna准确可靠的检测，但这些方法也有一定的缺陷，如重复性差，耗时，成本高且需要专业实验技能。电化学传感器因为其检测限低，特异性强，便携等特点，被广泛应用于各种生物标志物的检测，如用电化学传感器检测三磷酸腺苷，mirna，双链dna和肿瘤外泌体。
众所周知，ph在调节生命活动和许多生物进程（如细胞凋亡，酶催化和肿瘤生长）中起着至关重要的作用。由于这些原因，开发ph敏感的传感器或纳米材料对于疾病诊断，预后和药物释放尤为重要。三链连环dna是基于watson-crick和hoogsteen碱基对形成的，除正常的嘌呤和嘧啶配对外，还包含碱基三联体c-g•c+和t-a•t。第三链中胞嘧啶n3的质子化需要酸环境，而t-a•t结构需要中性条件。当三联体dna片段等量分布于tat和cgc时，微酸性ph值是形成三链连环dna的最佳条件。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于三链连环dna的超灵敏检测mirna的电化学生物传感器及制备方法和应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种基于三链连环dna的超灵敏检测mirna的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将直径为2mm的金电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净；
（2）取10µl、1µm的捕获探针固定液滴加到电极表面，加盖，室温孵育180min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（3）取10µl、2mm的巯基己醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，加盖，室温孵育90min，封闭电极表面的非特异性活性位点，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（4）取10µl含目标探针mirna-21的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得电极上，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（5）取10µl、1µm的连接探针缓冲液滴加到步骤（4）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（6）取10µl各含2µm的内环探针与外环探针的杂交缓冲液滴加到步骤（5）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（7）将含有50µm六氨合钌的电化学检测液通n2，15min；
（8）步骤（6）所得电极置于步骤（7）所得电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.2电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
步骤（1）的具体方法为：将直径为2mm的金电极在新鲜配制的piranha溶液（浓h2so4：30%h2o2=3:1v:v）中浸泡20min，然后依次用1、0.3、0.5µm的al2o3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，超纯水清洗，然后将电极置于0.5m的h2so4溶液中，在-0.35-1.6v电位下扫描，在0.95v出现一个尖锐的还原峰，在1.2~1.4v范围内出现三个小的，连续的氧化峰。
dna的预处理：将装有dna序列的ep管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到浓度为100µm的dna溶液，然后用含有500mmnacl，1mmedta的ph7.4的10mmtris-hcl稀释至10µm，实验过程所有用到的dna均按此进行预处理；
捕获探针固定液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，10mmtcep的ph7.4的10mmtris-hcl缓冲液中加入1µl，10µm的捕获探针，95℃加热5min，然后置于暗处2h内冷却至室温，使捕获探针形成发夹结构；
巯基己醇溶液的制备：取适量巯基己醇加至超纯水中，制成2mm的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
杂交缓冲液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，1mmmgcl2的ph7.410mmtris-hcl的缓冲液中加入1µl待测浓度的目标探针，混匀；
连接探针缓冲液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，1mmmgcl2的ph7.410mmtris-hcl的缓冲液中加入1µl，10µm的连接探针，混匀；
irp与orp杂交缓冲液的制备：分别取5µl，4µm的irp与orp制成2µm的缓冲液，然后95℃加热5min，置于暗处冷却至室温，形成三链连环dna连接的由许多小环组成的长核酸链；
电化学检测液的制备：ph7.4的10mmtris-hcl中含有50µm的六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用；
电化学工作站为chi660c，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为ph7.410mm的tris-hcl缓冲液。
该传感器组装中由表1所示的cp、lp、irp、orp4条ssdna单链和一条rna单链通过自组装形成。
表1.该传感器所用dna和rna序列
所述的制备方法制备的一种基于三链连环dna的超灵敏检测mirna的电化学生物传感器，用于mirna-21的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，所准备电极为工作电极，铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极，在8ml、10mm的ph5.0~9.0的tris-hcl缓冲液中进行测试；
（2）用差分脉冲伏安法对mirna-21进行检测，电压范围-0.6-0.2v，振幅为0.05v，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s。
本发明所用试剂均市售可得；
本发明适用于所有肿瘤细胞中mirna-21表达上调的检测。
本发明的有益成果：
（1）构建了基于三链连环dna的信号放大型超灵敏检测方法，产生强电化学信号，构建过程简单快速，无需标记且不需要任何酶参与。
（2）该生物传感器属于信号增强型传感器，整个过程不会有电化学信号产生，在最后一步，电活性物质与连环dna结合，产生强烈电信号，背景信号低，减少了假阳性的概率。
（3）该生物传感器具有高度的通用性，可延伸于检测其他类型的dna或rna生物标志物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的构建流程示意图。
图2为传感器在不同ph环境中的dpv响应。
图3a为实施例1中不同浓度目标物的电流响应。
图3b为实施例1中不同浓度目标物的电流响应标准曲线图。
图4a为本方法检测6例卵巢癌患者和6例正常人血清样本中mirna-21的结果。
图4b为本方法检测6例卵巢癌患者和6例正常人血清样本的平均mirna-21量。
具体实施方式：
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1，基于三链连环dna的超灵敏电化学生物传感器用于测定溶液中不同浓度的目标物mirna-21，得到传感器的电流响应标准工作曲线。
（1）将直径为2mm的金电极用al2o3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净；
（2）取10µl，1µm的捕获探针固定液滴加到电极表面，加盖，室温孵育180min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（3）取10µl，2mm的巯基己醇溶液滴加到步骤（2）所得电极表面，加盖，室温孵育90min，封闭电极表面的非特异性活性位点，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（4）取10µl含不同浓度目标探针mirna-21（浓度分别为：0m、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm、1nm、10nm）的杂交缓冲液滴加在步骤（3）所得电极上，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干;
（5）取10µl，1µm的连接探针缓冲液滴加到步骤(4)所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（6）取10µl含有内环探针与外环探针各2µm的杂交缓冲液滴加到步骤（5）所得电极表面，加盖，室温孵育60min，缓冲液冲洗电极表面，n2吹干；
（7）将含有50µm六氨合钌的电化学检测液通n2，15min；
（8）步骤6所得电极置于步骤7所得电化学检测液中，电化学工作站在-0.6~0.2电势范围内用差分脉冲伏安法扫描。
（9）测定结果如图3a所示，在1fm-10nm范围内，随着目标物浓度的增大，电化学信号增强，电流响应值增大。图3b为本实施例的电流响应标准工作曲线。
步骤（1）的具体方法为：将直径为2mm的金电极在新鲜配制的piranha溶液（浓h2so4：30%h2o2=3:1v:v）中浸泡20min，然后依次用1、0.3、0.5µm的al2o3抛光粉打磨，超纯水冲洗干净，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，超纯水清洗，然后将电极置于0.5m的h2so4溶液中，在-0.35-1.6v电位下扫描，在0.95v出现一个尖锐的还原峰，在1.2~1.4v范围内出现三个小的，连续的氧化峰。
dna的预处理：将装有dna序列的ep管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到浓度为100µm的dna溶液，然后用含有500mmnacl，1mmedta的ph7.4的10mmtris-hcl稀释至10µm，实验过程所有用到的dna和rna均按此进行预处理；
捕获探针cp固定液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，10mmtcep的ph7.4的10mmtris-hcl缓冲液中加入1µl，10µm的捕获探针，95℃加热5min，然后置于暗处2h内冷却至室温，使捕获探针形成发夹结构；
巯基己醇溶液的制备：取适量巯基己醇加至超纯水中，制成2mm的巯基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用；
杂交缓冲液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，1mmmgcl2的ph7.410mmtris-hcl的缓冲液中加入1µl待测浓度的目标物mirna-21（tp），混匀；
连接探针lp缓冲液的制备：在9µl，含有500mmnacl，1mmedta，1mmmgcl2的ph7.410mmtris-hcl的缓冲液中加入1µl，10µm的连接探针，混匀；
irp与orp杂交缓冲液的制备：分别取5µl，4µm的irp与orp制成2µm的缓冲液，然后95℃加热5min，置于暗处冷却至室温，形成三链连环dna连接的由许多小环组成的长核酸链；
电化学检测液的制备：ph7.4的10mmtris-hcl中含有50µm的六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用；
电化学工作站为chi660c，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极；
冲洗电极所用缓冲液为ph7.410mm的tris-hcl缓冲液。
该传感器组装中由表1所示的cp、lp、irp、orp4条ssdna单链和一条rna单链通过自组装形成。
表1.该传感器所用dna和rna序列
实施例2，基于三链连环dna的超灵敏电化学生物传感器应用于实际血清样品中的mirna-21含量检测
（1）按本发明所述制备方法构建电化学生物传感器，使用电化学工作站三电极体系进行测试，银/氯化银为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的传感器为工作电极，在8ml、10mm的ph6的电化学检测液（内含血清样品，血清样品与10mm电化学检测液体积比为1:1）中进行测试；
（2）用差分脉冲伏安法对上述电化学检测液进行检测，电势范围-0.6~0.2，振幅为0.05v，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.5s；
（3）测定结果如图4所示，患病者血清中mirna-21的表达明显高于正常人，卵巢癌患者中mirna-21的表达量约是正常人血清中mirna-21的2.2倍。
sequencelisting
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