本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种通用型纳米孔检测传感器及检测方法。
背景技术：
食品安全风险因子来源上大致可以分为生物源安全风险因子和非生物源性安全风险因子。生物源安全风险因子较为典型的如食源性致病菌和在致毒机制研究中具有重要生物学意义的microRNA；非生物源性食品安全风险因子如环境中的重金属。除此之外，食品安全风险因子种类繁多，不同种类风险因子间的联系愈发紧密，但目前想实现不同类型的风险因子的同时检测，还是一个技术难题。传统的检测方法依赖于大型的仪器设备或者免疫分析法等，通常耗时且不能进行现场检测。而一些生物学检测往往对于被检测的靶物质选择性较高，且同样很少可以通用性检测。
纳米通道是通过模仿生物膜离子通道选择性的筛选离子的功能而开发的一种纳米材料。相比较于生物离子通道，因为人工智能纳米通道的可调控性，易修饰基团以及具有更大的孔径便于通过大分子等优点，可作为纳米开关应用于药物递送或生物传感器来使用。
技术实现要素：
针对目前生物检测中存在的通用性差和效率低问题，本发明构建了一种基于EXPAR(Exponential Amplification Reaction，EXPAR)串联消解型HCR(Hybridization chain reaction，HCR)的通用纳米孔检测传感器，通过重金属Cr3+、miRNA的超灵敏检测对该传感器进行验证，实现了对靶物质的通用高效检测。
本发明的一个目的是提供一种检测传感器，所述传感器包括纳米多孔膜、发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2和促发子核酸序列，所述纳米多孔膜包括包含多个纳米孔的膜结构，所述膜结构包括A面和B面，所述A面和B面通过所述纳米孔连通，所述纳米孔的孔径为1～1000nm；
所述发卡型核酸序列1从5’端到3’端依次包括序列a、b、c、d、b’；
所述发卡型核酸序列2从5’端到3’端依次包括序列b’、a’、e、b、d’；
所述促发子核酸序列从5’端到3’端依次包括序列b’、a’；
所述b与b’的核酸序列反向互补杂交，所述a与a’的核酸序列反向互补杂交，所述d与d’的核酸序列反向互补杂交，所述c、e包括核苷酸个数为1个以上的任意核酸序列；
所述促发子核酸序列连接在所述纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分；所述纳米多孔膜的B面和/或纳米孔的内表面中靠近B面的部分带正电荷。
所述A面和B面没有顺序或方向的区别，仅用来简单的区分纳米多孔膜的不同的面。
具体的，所述传感器包括下述1)-4)所述中的至少一种：
1)所述c、e包括核苷酸个数为15个的任意核酸序列；
具体的，所述c为5’-AAAAAAAAAAAAAAA-3’；所述e为5’-GGGGGGGGGGGGGGG-3’；
2)所述b、b’的核苷酸个数为18个；
3)所述a、a’、d、d’的核苷酸个数为6个；
4)所述纳米多孔膜为AAO膜，所述A面、B面、纳米孔的内表面修饰有氨基，所述促发子核酸序列通过戊二醛连接在所述纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分的氨基上；具体的，所述促发子核酸序列为胺化的促发子核酸序列。
具体的，所述传感器包括下述1)-3)所述中的至少一种：
1)所述促发子核酸序列为序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述促发子具有相同功能的核苷酸序列；
所述功能包括与所述发卡型核酸序列1的部分核苷酸序列反向互补杂交；或打开所述发卡型核酸序列1的发卡结构，使得所述发卡型核酸序列1变为单链状态；
2)所述发卡型核酸序列1为序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列1具有相同功能的核苷酸序列；
所述功能包括与所述促发子的部分和/或全部核苷酸序列反向互补杂交；且与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述发卡型核酸序列2变为单链状态；
3)所述发卡型核酸序列2为序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述发卡型核酸序列2具有相同功能的核苷酸序列。
所述功能包括与所述发卡型核酸序列1的部分核苷酸序列反向互补杂交，或使得所述发卡型核酸序列1变为单链状态。
具体的，所述传感器还包括非对称修饰的纳米多孔膜，所述非对称修饰的纳米多孔膜的制备方法包括：
将本发明任一所述的纳米多孔膜浸泡在含氨基丙基三甲氧基硅烷的溶液中，置于70℃烘箱2个小时；
再将本发明任一所述的纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分浸泡在含戊二醛的溶液中过夜；
然后将本发明任一所述的纳米多孔膜浸泡在含有胺化的本发明任一所述的促发子核酸序列的HCR反应缓冲液中，28℃孵育3h；
最后将本发明任一所述的纳米多孔膜浸泡在含有本发明任一所述的发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2的HCR反应缓冲液中，28℃孵育6个小时即得。
具体的，所述HCR反应缓冲液为8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH＝7.4，溶剂为水。
具体的，所述含氨基丙基三甲氧基硅烷的溶液为质量分数为5％的氨基丙基三甲氧基硅烷的丙酮溶液；
具体的，所述含戊二醛的溶液为质量分数为25％的戊二醛水溶液；
具体的，所述的促发子核酸序列的浓度为1μM；
具体的，所述的发卡型核酸序列1、发卡型核酸序列2的浓度分别均为1μM；
所述A面和B面没有顺序或方向的区别，仅用来简单的区分所述纳米多孔膜的不同的面。
具体的，所述传感器还包括核酸序列3和核酸序列4；
所述核酸序列3从5’端到3’端依次包括序列f、g、x’；
所述核酸序列4从5’端到3’端依次包括序列h、i、j；
所述g、i中包含内切酶识别和/或酶切核酸序列的反向互补杂交序列；具体的，所述内切酶识别和/或酶切核酸序列的反向互补杂交序列为5'-GACTC-3'；具体的，所述g为5'-AACTGACTCGG-3'；所述i为5'-AACAGACTCGG-3'
所述x’包含与待测靶标核酸序列互补杂交的核酸序列；
所述f、h或j均各自包含a’、e。
具体的，所述传感器还包括下述1)-3)所述中的至少一种：
1)所述f、h或j均各自从5’端到3’端依次包括b’的部分核酸序列、a’、e、b的部分核酸序列；
具体的，所述b’的部分核酸序列包括b’的3’端的部分核苷酸序列；所述b的部分核酸序列包括b的5’端的部分核苷酸序列；
2)所述f、h、j任意一条序列的反向互补杂交序列，与所述发卡型核酸序列2的互补杂交的△G，是所述发卡型核酸序1与所述发卡型核酸序2互补杂交的△G的两倍以上；具体的，为两倍；
3)所述f、h、j任意一条序列的反向互补杂交序列，与所述发卡型核酸序列2互补杂交所需要的最低反应温度，要低于所述发卡型核酸序1或所述发卡型核酸序2自身的解链温度Tm；
具体的，所述传感器包括下述1)-3)所述中的至少一种：
1)序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列3具有相同功能的核苷酸序列；
所述相同功能包括与待测靶标核酸序列互补杂交，且其本身的互补杂交链与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交；
2)序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列3具有相同功能的核苷酸序列；
所述相同功能包括与待测靶标核酸序列互补杂交，且其本身的互补杂交链与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交；
3)序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核酸序列4具有相同功能的核苷酸序列。
所述相同功能包括其本身的互补杂交链与所述发卡型核酸序列2的部分核苷酸序列反向互补杂交。
具体的，所述传感器还包括下述1)-8)所述中的至少一种：
1)HCR反应缓冲液；
具体为：8.0mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,2.0mM MgCl2,0.15mM NaCl,溶剂为水，pH 7.4；
2)DNA聚合酶；
具体为Bst.polymerase；
3)内切酶；
具体为Nt.Bst.NBI；
4)EXPAR反应缓冲液；
具体为NE buffer 3.1、Themofer buffer；
5)dNTP；
6)序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；
7)序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；
8)电极、电解质溶液、电流和/或电压表、电解槽中的至少一种。
具体的，所述电极为Ag/Agcl；所述电解质溶液为KCl溶液；所述电流和/或电压表为数字源表。
本发明的另一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括下述1)或2)：
1)利用本发明任一所述传感器进行HCR反应，获得非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜，所述非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜包括所述纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分连接有HCR产物；
进行消解反应，所述消解反应包括：将待测物、非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜、HCR反应缓冲液混合孵育；
具体的，所述HCR反应缓冲液为8.0mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,2.0mM MgCl2,0.15mM NaCl,溶剂为水，pH 7.4；
对消解反应完成后的非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜进行电流检测，如果检测到的电流的开关比为150以上时，则待测物中含有待测靶标核酸序列；
所述电流的开关比为相同扫描电压下，含有待测物的样品监测到的电流与空白对照检测到的电流的比值；
2)利用本发明任一所述检测模块进行HCR反应，获得非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜，所述非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜包括所述纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分连接有HCR产物；
利用本发明任一所述检测模块中的核酸序列3和核酸序列4与待测物一起进行EXPAR反应，获得EXPAR反应产物；
进行消解反应，所述消解反应包括：将所述EXPAR反应产物或EXPAR反应完成后的反应体系，与非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜、HCR反应缓冲液混合孵育；
具体的，所述HCR反应缓冲液为8.0mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,2.0mM MgCl2,0.15mM NaCl,溶剂为水，pH 7.4；
对消解反应完成后的非对称修饰了HCR产物的纳米多孔膜进行电流检测，如果检测到的电流的开关比为150以上时，则待测物中含有待测靶标核酸序列；
所述电流的开关比为相同扫描电压下，含有待测物的样品监测到的电流与空白对照检测到的电流的比值；
具体的，所述HCR反应包括：将连接促发子核酸序列的纳米多孔膜、发卡型核酸序列1和发卡型核酸序列2加入反应缓冲液中，28℃孵育6个小时；所述连接促发子核酸序列的纳米多孔膜包括所述促发子核酸序列连接在所述纳米多孔膜的A面和/或纳米孔的内表面中靠近A面的部分。
具体的，所述EXPAR反应包括：将待测物、核酸序列3、核酸序列4、聚合酶和内切酶的反应缓冲液、dNTP、超纯水置于反应管中混匀于55℃加热2min以上，具体为3min以上，再具体为5min；取出反应管加入聚合酶、内切酶、超纯水混匀，置于PCR仪中55℃，40个循环以上，具体为250个循环：
再具体的，所述聚合酶为Bst.polymerase；所述内切酶为Nt.Bst.NBI；
再具体的，所述取出反应管加入聚合酶、内切酶、超纯水混匀前，可加入荧光染料；所述荧光染料具体为SYBR Green I；
具体的，所述消解反应中，所述混合孵育包括28℃孵育1h；
具体的，检测金属离子时，所述方法还包括：先通过金属核酶将金属离子的信号转换为核酸序列信号，然后将该转换的核酸序列作为待测靶标核酸序列。
具体的，当待测物为金属离子Cr3+时，所述方法还包括：将序列表中SEQ ID№：4、SEQ ID №：5所示核苷酸序列和反应缓冲液水浴3分钟，退火后放入加热装置中25℃放置15分钟，然后加入含Cr3+的反应缓冲液，28℃反应30min，反应完后加EDTA终止液终止反应，即得含待测靶标核酸序列的反应体系，将所述反应体系或待测靶标核酸序列作为待测物进行所述EXPAR反应。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述传感器、本发明任一所述检测方法的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)所述中的至少一种：
1)用于检测生物样品；
具体的，所述生物样品包括转基因产品、微生物、核酸分子；
再具体的，所述核酸分子为miRNA；所述miRNA为Let-7a；
具体的，用于检测生物样品时，可选取生物样品中的特征序列的一部分或全部，作为待测靶标核酸序列；
2)用于检测非生物样品；
具体的，所述非生物样品包括金属；
再具体的，所述金属为Cr3+；
3)用于制备检测生物样品或非生物样品的产品及其相关产品。
具体的，所述生物样品包括转基因产品、微生物、核酸分子；
再具体的，所述核酸分子为miRNA；所述miRNA为Let-7a；
具体的，用于检测生物样品时，可选取生物样品中的特征序列的一部分或全部，作为待测靶标核酸序列；
具体的，所述非生物样品包括金属；
再具体的，所述金属为Cr3+。
本发明的优点及有益技术效果：
1、本发明的通用纳米孔检测平台能够对非生物靶标重金属铬和生物靶标miRNA等多种靶目标进行超灵敏检测，对10pM以上的铬离子以及1pM以上的miRNA具有很好的灵敏响应。
2、本发明的通用纳米孔检测平台能够对重金属铬和miRNA等多种靶目标进行特异性检测。
3、将电化学纳米孔传感器结合EXPAR-消解型HCR通用模块，可在1个小时左右实现靶标物质的快速检测。
附图说明
图1为AAO纳米多孔膜非对称修饰结果验证图，其中，图1A为纳米孔非对称I-V曲线(扫描电压±2V)；图1B为装载HCR长双链与无HCR修饰的跨膜离子流变化。
图2为Cr3+核酶切割验证20％聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中泳道1-8的样品分别为：1、400nM底物链；2、400nM酶链；3、400nM底物链，400nM酶链；4、400nM底物链，400nM酶链，50nM Cr3+；5、200nM底物链，400nM酶链，100nM Cr3+；6、200nM底物链，400nM酶链，200nM Cr3+；7、裂解底物链1；8、裂解底物链2。
图3为实时定量PCR验证所建立的EXPAR的扩增效率的结果图，其中，图3A为不同Cr3+浓度时的扩增曲线图，图3B为POI值与不同浓度的Cr3+线性方程。
图4为利用非对称纳米孔体系检测Cr3+的结果图，其中图4A为电流测试结果图，图4B为Cr3+离子浓度与开关比的曲线图。
图5为利用非对称纳米孔体系检测Cr3+的特异性结果图。
图6为实时定量PCR验证所建立的EXPAR的扩增效率的结果图，其中，图6A为不同let-7a浓度时的扩增曲线图，图6B为POI值与不同浓度的let-7a的线性方程。
图7为利用非对称纳米孔体系检测let-7a的结果图，其中图7A为电流测试结果图，图7B为let-7a浓度与开关比的曲线图
图8为利用非对称纳米孔体系检测let-7a的特异性结果图。
图9为消解型纳米孔传感器的电子扫描电镜表面验证结果图，其中图9a为未修饰HCR产物的AAO膜；图9b,c为修饰HCR产物的AAO膜；图9d为加入了消解链Y1个小时后的AAO膜。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
具体的，实验电流曲线测试是在电化学装置中进行的，工作电极是Ag/Agcl电极，电解质溶液是KCl溶液(pH 5.6左右)。孔膜的电学信号是用数字源表测量得到的。AAO膜被夹在电解槽中间，测试前需要检测是否含有气泡。数字源表2636B购于美国吉事利公司；电子扫描显微镜购于奥林巴斯公司；电解槽购合肥普元纳米科技局有限公司；琼脂糖凝胶电泳图像由美国UVP公司的BioDoc-It系统获得；琼脂糖凝胶成像系统使用的是美国UVP公司的Bio Doc-It成像系统。Real time PCR使用的是美国ABI公司。所有合成的DNA序列在英维捷基公司；SYBR Gold核酸染料，GeneRuler超低分子量DNA Ladder和6×DNA上样缓冲液均购自于赛默飞世尔科技有限公司；Bst DNA聚合酶，Nt.Bst NBI核酸内切酶和相应的buffer购自于美国纽英伦生物技术有限公司；超纯水来自于Milli-Q净化系统，其它试剂均为分析纯；AAO纳米多孔膜购于合肥普元纳米科技科技局有限公司。
实施例1
采用基于EXPAR串联消解型HCR的通用纳米孔检测平台检测金属铬离子的方法，包括以下内容：
(一)消解型HCR核苷酸序列的准备
本实施例设计的消解型HCR核苷酸序列如表1所示。
表1
表1中，D-H1为消解发卡1，D-H2为消解发卡2
(二)非对称纳米孔传感器的构建
(1)将AAO纳米多孔膜浸泡到乙醇中超声处理15分钟清洗，清洗完后将其浸泡在质量分数为5％的盐酸溶液(溶剂为水)，中30秒用以舒展膜表面的羟基，再用超纯水冲洗，烘干；
(2)将上述(1)制备好的AAO纳米多孔膜浸泡在质量分数为5％的氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)的丙酮溶液中，2个小时后取出，放入70℃烘箱2个小时，即完成了将氨基固定在纳米孔上的过程。
(3)非对称修饰:使用气柱辅助模具(模具含电解槽，购自合肥普元纳米科技局有限公司)，将AAO纳米多孔膜至于两个模具之间，纳米多孔膜的一端的模具中加了质量分数为25％戊二醛溶液并与膜联通。另外一个模具中不加戊二醛溶液，仅仅反转过来作为固相支撑。为了保持好的封闭性，在模具与AAO纳米多孔膜之间需使用一张PET膜(将AAO膜放在PET膜中间，然后将PET膜夹在两个模具中间。模具放在电解槽中，电解槽放入戊二醛)，保证封闭性。
将纳米多孔膜的一端浸泡在质量分数为25％戊二醛溶液中(溶剂为水)过夜，即将羰基固定在了纳米多孔膜的一端，之后用超纯水清洗。
然后将AAO纳米多孔膜从模具上取下，清水清洗三遍，将膜浸泡在1mL含有1μM胺化的促发子(胺化的促发子购买自英潍捷基)的HCR反应缓冲液中，28℃孵育3h。所述HCR反应缓冲液为8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH＝7.4，溶剂为水。反应完后，清水清洗三遍，将膜浸泡在1mL含有1μM D-H1,D-H2的缓冲液中(所述缓冲液为8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH＝7.4，)，28℃孵育6个小时，得非对称修饰的AAO纳米多孔膜。
非对称修饰的AAO纳米多孔膜的电流测试：实验测试是在电化学装置中进行的，工作电极是AgCl/Ag电极，工作电解质溶液是氯化钾溶液(Ph 5.6左右)，用美国吉时利2626B数字源表测量得到。AAO膜被夹在两个模具(模具含有电解槽，电解槽中有电解质溶液)中间进行检测。检测结果如图1所示。
图1为非对称修饰的AAO纳米多孔膜的电流测试结果图。如图1A所示，纳米孔非对称I-V曲线表明在不同的扫描电压下纳米孔出现了明显的电流非对称现象，表明了纳米孔对离子流的偏向性，只允许离子流单方向通过。这是因为胺化了的纳米孔一端修饰了戊二醛，另外一端没有修饰。所以胺化了的HCR促发子只能加成在修饰了戊二醛一端的纳米孔上，另外一端因为没有促发子，所以不能产生DNA超分子长双链。于是非对称纳米孔一端孔里充满了很多DNA链，呈现满孔且为负电区；纳米孔另外一端则没有DNA链，呈现空孔状态且为正电区(氨基)。通过不同电压扫描后，便出现了图1A中的非对称曲线，证明了纳米孔被DNA成功的进行了非对称修饰。图1B中表明当纳米孔没有修饰HCR发夹结构，纳米孔里没有形成DNA长双链时，在扫描电压电流范围内，有电流通过纳米孔，纳米孔呈现开孔状态(圆点)。而当在纳米孔上修饰了HCR长双链后，通过纳米孔电流急剧降低(方点)，表明修饰上的HCR产物成功堵住纳米孔，几乎无电流通过。
(三)铬离子核酶和EXPAR扩增用到的序列的准备
本实施例设计的EXPAR扩增用序列和铬离子核酶及底物序列如表2所示
表2
表2中，Cr3+金属核酶的底物链中的r表示任意RNA。
(四)“核酸中间体X”过渡态核酸靶标的获得
按表3配制A体系，将A体系95℃水浴3分钟，退火后放入加热装置中25℃放置15分钟，然后按表4配制成B体系，28℃条件下反应30min，反应完后加5μL的25mM EDTA终止液终止反应。其中，表3、表4中的缓冲液均为50mM MES pH 6.0、25mM NaCl、0.8mM磷酸二氢钠，溶剂为水。
A体系如表3所示。
表3
B体系如表4所示。
表4
采用聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳验证酶切效果，跑胶结束后，SYBR Gold核酸染料染10min，然后用分子凝胶成像仪Doc It采集图像。结果如图2所示，泳道1是Cr3+金属核酶的底物链；泳道2是Cr3+金属核酶的酶链；泳道7，8是Cr3+金属核酶的底物链被切割后的两个单链；由PAGE凝胶图可以看出，泳道3，4，5，6有单链被切割出来，且被切割的单链长度与泳道7，8的单链长度相近。证明核酶的底物链被酶链切割。对比4，5，6泳道中的被切割的单链的亮度，随着Cr3+浓度增大，亮度越来越深，说明随着Cr3+浓度增大，被切割的单链的量越来越多。但泳道3也有小部分的底物链被切割，说明在没有Cr3+存在的情况下，该金属核酶也有较弱的切割活性。
(五)通过EXPAR扩增反应形成大量消解链
本实施例建立的EXPAR反应体系分为A,B两个体系，分别如表5、表6所示。采用real-time PCR方法验证建立的EXPAR反应体系。
A体系如表5所示。
表5
B体系如表6所示。
表6
EXPAR反应条件：
将A体系中除SYBR Green I的样品加好后混匀，分装在各个管中，放于55℃加热5min。取出后加入SYBR Green I(尽量避光)。将B体系加入A体系中，离心混匀反应物，放于实时定量PCR仪中反应。设计程序为55℃，250个循环。
实验结果如图3所示。图3A显示，随着Cr3+浓度的增加，实验组与空白对照之间POI值(荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)差值变小，表明扩增效率随着Cr3+浓度的升高而增大。在Cr3+的浓度为10pM～100nM范围内，扩增单链时间为20min～30min左右(一个循环数为4秒，加上15秒的读数时间)。如图3B所示，在Cr3+的浓度为10pM～100nM范围内，荧光信号与靶物质浓度呈现较好的线性关系，线性方程为POI＝-1.1lgCMCr3++27.5,(R2＝0.9880)。此外，在Cr3+浓度为1pM时，POI值已经与10pM的POI值无法区分，证明该模块对Cr3+最灵敏检测范围为10pM～100nM。
(六)利用非对称纳米孔体系检测Cr3+
将本实施例步骤(五)完成的反应体系吸取45μL加入到1mL反应溶液中，与本实施例步骤(二)构建的非对称修饰了HCR长双链的纳米多孔膜即非对称修饰的AAO纳米多孔膜一起28℃孵育1h，其中，反应溶液为8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH＝7.4，溶剂为水。
反应完后进行电流测试：实验测试是在电化学装置中进行的，工作电极是AgCl/Ag电极，工作电解质溶液是氯化钾溶液(Ph 5.6左右)，用美国吉时利2626B数字源表测量得到。AAO膜被夹在两个模具(模具含有电解槽，电解槽中有电解质溶液)中间。电压为正负2V。实验结果如图4所示。
如图4A所示，图中由三角形组成的曲线代表纳米孔表面只修饰了促发子的电流测试结果；由方框组成的曲线代表纳米孔表面通过促发子和D-H1,D-H2修饰后的电流测试结果；由圆圈组成的曲线代表纳米孔表面通过促发子和D-H1,D-H2修饰后并与上述本实施例步骤(五)完成的反应体系(含消解链Y)反应完成后的电流测试结果。下述所述的开关比为相同扫描电压下，含有待测物的样品监测到的电流与空白对照检测到的电流的比值。
三角形组成的曲线与方框组成的曲线相比，穿孔的离子电流相差较大，从12.2×10-9A下降至4.53×10-11A，开关比为269。这可能是由于DNA的超级结构具有良好的延展性，可以比较贴合的填充AAO膜纳米孔道。所以在HCR产物自组装到纳米孔中时，纳米孔呈现闭孔状态，几乎无电流通过；在加入含有消解单链Y的反应体系后,电流从初始的4.53×10-11A上升至9.38×10-9A(由圆圈组成的曲线)，开关比达207。说明消解单链Y对HCR产物进行了大量消解，纳米孔由闭孔状态变为开孔状态。
通过使用不同浓度的Cr3+离子转化得到的单链产物Y刺激纳米孔结果如图4B所示，由I-V曲线可知，当Cr3+离子浓度继续上升，开关比急剧降上升，从153到269，到100nM时开关比达到平台。说明基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对10pM以上的Cr3+离子具有很好的灵敏响应，可以对重金属离子进行监测。
通过本实施例建立的基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对不同金属离子进行检测，进行特异性验证实验。
实验结果如图5所示，从纳米孔的开关比(On-Off ratio)可以看出，本实施例建立的基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对Cr3+离子的检测有很好的特异性。
实施例2
采用基于EXPAR串联消解型HCR的通用纳米孔检测平台检测miRNA的方法，具体包括如下内容：
(一)消解型HCR核苷酸序列的准备
具体序列与实施例1表1相同。
(二)非对称纳米孔体系的构建
构建方法与实施例1(二)所述相同。
(三)EXPAR扩增用到的序列的准备
本实施例设计的EXPAR扩增用序列和待检测miRNA如表7所示
表7
(四)通过EXPAR扩增反应形成大量消解链
本实施例建立的EXPAR反应体系分为A,B两个体系，分别如表8、表9所示。
A体系如表8所示。
表8
B体系如表6所示。
表6
EXPAR反应条件：
将A体系中除SYBR Green I的样品加好后混匀，分装在各个管中，放于55℃加热5min。取出后加入SYBR Green I(尽量避光)。将B体系加入A体系中，离心混匀反应物，放于实时定量PCR仪中反应。设计程序为55℃，250个循环。
采用real-time PCR方法验证建立的EXPAR反应体系。
实验结果如图6所示。图6A显示，随着待测miRNA let-7a浓度的增加，实验组与空白对照之间POI值(荧光曲线最大斜率处所对应的时间值)差值变小，表明扩增效率随着let-7a浓度的升高而增大。在let-7a的浓度为1pM～10nM范围内，扩增单链时间为20min～30min左右(一个循环数为4秒，加上15秒的读数时间)。如图6B所示，在let-7a的浓度为1pM～10nM范围内，荧光信号与靶物质浓度呈现较好的线性关系，线性方程为POI＝-2.5lgCmiRNA+12.5,(R2＝0.9998)。此外，在let-7a浓度为100fM时，POI值已经与1pM的POI值无法区分，证明该模块对let-7a最灵敏检测范围为10pM～100nM。
(五)利用非对称纳米孔体系检测miRNA
将本实施例步骤(四)完成的不同浓度的待测miRNA反应出来的EXPAR扩增反应体系各吸取45μL分别加入到1mL反应溶液中，再分别与本实施例步骤(二)构建的非对称修饰了HCR长双链的纳米多孔膜即非对称修饰的AAO纳米多孔膜一起28℃孵育1h，其中，反应溶液为8mM Na2HPO4,2.5mM NaH2PO4,0.15M NaCl,2mM MgCl2,pH＝7.4，溶剂为水。
反应完后进行电流测试，电流测试步骤与实施例1(六)所述相同。电流测试结果如图7所示。
如图7A所示，图中由三角形组成的曲线代表纳米孔表面只修饰了促发子的电流测试结果；由方框组成的曲线代表纳米孔表面通过促发子和D-H1,D-H2修饰后的电流测试结果；由圆圈组成的曲线代表纳米孔表面通过促发子和D-H1,D-H2修饰后并与上述本实施例步骤(四)完成的反应体系(含消解链Y)反应完成后的电流测试结果。
三角形组成的曲线与方框组成的曲线相比，穿孔的离子电流相差较大，电流从14.6×10-9A下降至5.2×10-11A，开关比为281；这可能是由于DNA的超级结构具有良好的延展性，可以比较贴合的填充AAO膜纳米孔道。所以在HCR产物自组装到纳米孔中时，纳米孔呈现闭孔状态，几乎无电流通过；在加入含有消解单链Y的反应体系后,电流从初始的5.2×10-11A上升至9.7×10-9A(由圆圈组成的曲线)，开关比为186；说明消解单链Y对HCR产物进行了大量消解，纳米孔由闭孔状态变为开孔状态。
通过使用不同浓度的miRNA转化得到的单链产物Y刺激纳米孔结果如图7B所示，从I-V曲线可知，随着不同浓度的miRNA(从100fM-1pM)下，开关比基本在25左右，近似裸孔的开孔状态；当miRNA浓度继续上升，开关比急剧降上升从175上升到281，到10nM时开关比达到平台。这说明基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对1pM以上的miRNA具有很好的灵敏响应，可以对miRNA进行监测
通过本实施例建立的基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对不同miRNA进行检测，进行特异性验证实验。
实验结果如图8所示，从纳米孔的开关比(On-Off ratio)可以看出，基于EXPAR串联HCR的通用纳米孔检测平台对于和miRNA let-7a同一家族的其他miRNA没有很好的区分，主要原因是因为EXPAR扩增过程不能区分单碱基的特异性，而let-7a家族的其他miRNA与let-7a只有一两个碱基不同，且不同的碱基位于切割位点之前，不会影响其与模版的扩增，所以对let-7a家族的miRNA特异性低，但对其他家族的miRNA有较好的区分，检测的特异性好。
实施例3
消解型纳米孔传感器的表面验证实验
上述实施例1(二)所构建的非对称纳米孔传感器，电流测试结果图图1中的I-V曲线表明，HCR产物(即由表1中的促发子促发的表1中的D-H1与D-H2自组装成带长缺口的超级DNA双链分子)被成功修饰到了纳米孔，且HCR产物有效的对纳米孔进行了堵孔，且成非对称的状态。为了保证纳米孔的堵孔状态，进一步通过电子扫描电镜来观察纳米孔的表面状态确定DNA是否在AAO膜的表面进行了组装。由图9a可知，未修饰HCR产物的AAO膜可以清晰的看到排列均匀的孔道结构，且表面清洁，呈现良好的开孔状态。修饰了HCR产物后，图9b,c中可以看出，较于图9a大多数孔道表面蒙了一层膜，表明DNA超级结构成功装载在AAO膜表面。图1的I-V曲线和图9的电子扫描电镜同时证明了在纳米孔道内确实触发了杂交链式反应，得到了DNA超分子结构。图9d为加入了消解链Y(见表2)1个小时后，纳米孔呈现的状态。实验结果显示，纳米孔道表面覆盖的一层膜消失，证明HCR生成的DNA超分子长双链在孔中被消解单链消解，纳米孔呈现开孔状态。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。