本发明涉及一种温胃舒颗粒指纹图谱的构建方法，属于药物分析领域。
背景技术
中药已有几千年的应用发展历史，但如何评价中药的质量，一直是中药研究的重点和难点，中药指纹图谱是指某种或某产地中药材或中成药经过适当的处理后，采用一定的分析方法，得到的能够标志这种中药材或中成药特征的色谱图或者光谱图。
“胃寒请用温胃舒，胃热请用养胃舒”，这句曾经享誉全国、众口皆知的广告词依然让很多人耳熟能详。温胃舒是根据解放军105医院金乃时教授和安徽中医学院苏春榔教授研制的“温胃汤”加减开发的产品。其独特之处在于体现了中医辨证施治、同病异治、一病两药的特色。温胃舒颗粒自1985年批准上市以来，经过30年临床应用，其辨证分型治疗脾胃阳虚、脾胃阴虚和慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎等方面获重大突破，显示出特有的临床应用优势，也因此获得诸多荣誉。
温胃舒颗粒是由党参、肉桂、白术(炒)、附子(黑顺片)、山药、山楂(炒)、陈皮、黄芪(炙)、肉苁蓉(制)、乌梅、补骨脂和砂仁组成的中药复方制剂。目前执行的标准为药典业发(2000)第28号附文和药典业发(2001)第539号。随着科技的进步和严格的药品质量需求，现行标准的提升势在必行。前期公司对温胃舒颗粒的质量标准进行了一定的研究并申请了“一种温胃舒颗粒的质量检测方法”的专利，在一定程度上加强了温胃舒颗粒的质量控制。但中成药的组方药味多，化学成分复杂，采用单一成分作为质控指标已越来越不适应中药质量控制的要求。
因此，为了从整体上全面反映温胃舒颗粒的质量，保证患者用药更加安全有效，建立一种能够全面地、快速地检测温胃舒颗粒质量的方法，对于其质量检测和整体质量控制具有重要意义。
技术实现要素：
为了避免上述现有技术所存在的不足之处，本发明旨在提供一种温胃舒颗粒指纹图谱的构建方法。本方法操作简便、重现性好、精密度高，能够用于温胃舒颗粒的质量检测和质量控制。
本发明方法有效的解决了现有的温胃舒颗粒的质量检测方法不能从整体上全面反映温胃舒颗粒的质量、进而导致质量检测结果可能缺乏客观性和准确性、从而无法保证温胃舒颗粒临床用药的安全性和有效性的问题。
所述温胃舒颗粒的原料药组成为党参、肉桂、白术(炒)、附子(黑顺片)、山药、山楂(炒)、陈皮、黄芪(炙)、肉苁蓉(制)、乌梅、补骨脂和砂仁。
本发明温胃舒颗粒指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：供试品溶液的制备
称取5.0-10.0g温胃舒颗粒加入25-100ml甲醇水溶液中，10-60℃下超声处理10-60min，冷却后过滤，所得滤液即为供试品溶液；
步骤2：对照品溶液的制备
以甲醇为溶剂，称取橙皮苷、补骨脂素、异补骨脂素分别配制成对照品溶液；
步骤3：色谱检测
分别吸取供试品溶液及对照品溶液各5-20μl，注入高效液相色谱仪检测，分别得到供试品溶液和对照品溶液的色谱图；
色谱检测参数如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a、以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱；检测波长为230-235nm；柱温25-40℃；流速为0.5-1.5ml/min。
梯度洗脱程序设置如下：
0min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
0-5min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
5min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
5-20min，流动相a所占体积由15％逐步递增至25％，余量为流动相b；
20min，流动相a所占体积为25％，余量为流动相b；
20-45min，流动相a所占体积由25％逐步递增至45％，余量为流动相b；
45min，流动相a所占体积为45％，余量为流动相b；
45-50min，流动相a所占体积由45％逐步递增至80％，余量为流动相b；
50min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
50-55min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
55min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
55-60min，流动相a所占体积由80％逐步递减至15％，余量为流动相b；
60min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
60-65min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
65min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b。
步骤4：利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液和对照品溶液的色谱图分别进行数据导入、多点校正和数据匹配，采用中位数法，时间宽度为0.3min，即得指纹图谱。
优选地，步骤1中，称取5.0-8.0g温胃舒颗粒加入25-50ml体积浓度50-100％的甲醇水溶液中，10-60℃下超声处理20-40min，冷却后过滤，所得滤液即为供试品溶液。
进一步优选，步骤1中，称取7.5g温胃舒颗粒加入25ml体积浓度80-100％的甲醇水溶液中，10-60℃下超声处理30min，冷却后过滤，所得滤液即为供试品溶液。
优选地，步骤2中，对照品溶液中，橙皮苷溶液的浓度为0.1mg/ml，补骨脂素的浓度为0.025mg/ml，异补骨脂素的浓度为0.025mg/ml。
优选地，步骤3中，供试品溶液及对照品溶液的进样量为5-15μl，检测波长为232nm；柱温30℃；流速为1.0ml/min。
进一步优选，步骤3中，供试品溶液及对照品溶液的进样量为10μl。
优选地，步骤3中，色谱检测时使用250mm×4.6mm，5μm的agilenteclipsexdb-c18色谱柱。
本发明获得的温胃舒颗粒的指纹图谱中，共有峰为：1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰橙皮苷、6号峰、7号峰、8号峰补骨脂素和9号峰异补骨脂素；以5号峰为参照峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.433、2号峰0.479、3号峰0.533、4号峰0.892、5号峰1.000、6号峰1.365、7号峰1.578、8号峰1.629和9号峰1.696。
按照保留时间偏差不大于±5％的原则，将保留时间规定为：
1号峰：0.429±0.022；2号峰：0.479±0.024；3号峰：0.533±0.027；4号峰：0.892±0.045；5号峰：1.000；6号峰：1.365±0.068；7号峰：1.578±0.079；8号峰：1.629±0.081；9号峰：1.696±0.085。
本发明构建的温胃舒颗粒指纹图谱的应用，是利用本发明构建的指纹图谱检测温胃舒颗粒制剂的质量，具体包括如下步骤：
步骤1：待测品溶液的制备
精密称取5.0-10.0g待测温胃舒颗粒，加入25-100ml体积浓度0～100％的甲醇溶液，10-60℃超声处理10-60min，冷却后过滤，所得滤液即为待测品溶液；
步骤2：对照品溶液的制备
以甲醇为溶剂，称取橙皮苷、补骨脂素、异补骨脂素适量分别配制成对照品溶液；对照品溶液中，橙皮苷溶液的浓度为0.1mg/ml，补骨脂素的浓度为0.025mg/ml，异补骨脂素的浓度为0.025mg/ml。
步骤3：色谱检测
分别吸取待测品溶液及对照品溶液各5-20μl，注入高效液相色谱仪检测，分别得到待测品溶液和对照品溶液的色谱图；检测参数与温胃舒颗粒指纹图谱构建时的色谱检测参数相同；
步骤4：利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，将所得待测品图谱与构建的标准指纹图谱相比对，计算指纹图谱相似度，若相似度≥0.9且出现标准指纹图谱中的9个特征峰，与参照峰相应的峰为s峰，计算各共有峰与s峰的相对保留时间，以s峰为内参照峰，按照保留时间偏差不大于±5％的原则，将保留时间规定为：
1号峰：0.429±0.022；2号峰：0.479±0.024；3号峰：0.533±0.027；4号峰：0.892±0.045；5号峰：1.000；6号峰：1.365±0.068；7号峰：1.578±0.079；8号峰：1.629±0.081；9号峰：1.696±0.085。
各峰的相对保留时间在上述范围之内，则该温胃舒颗粒质量合格，反之则不合格。
本发明所采用的温胃舒颗粒为经现行标准检验合格的10批样品。
本发明提供了一种操作简便、重现性好、精密度高的温胃舒颗粒指纹图谱的构建方法，通过指纹图谱的构建可用来控制制剂的质量，且稳定性和重复性良好，可用于温胃舒颗粒生产工艺监控、质量评价中的检测，以确保温胃舒颗粒的质量符合标准。
本发明供试品的制备方法简便，色谱条件容易实现。
本发明构建的温胃舒颗粒指纹图谱的方法，具有稳定性好、精密度高、重复性好等优点，可以用于温胃舒颗粒的生产过程监测和质量控制中，从而有助于提高该药物临床用药的有效性和安全性。
附图说明
图1为本发明实施例3中橙皮苷对照品溶液的液相色谱图；
图2为本发明实施例3中补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液的液相色谱图；
图3为本发明实施例3温胃舒颗粒供试品溶液(批号：1701003)的液相色谱图；
图4为本发明实施例3中10批温胃舒颗粒供试品溶液导入指纹图谱相似度计算软件后导出的叠加色谱图；
图5为本发明实施例3中建立的温胃舒颗粒的指纹图谱。
具体实施方式
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例仪器与试药：
仪器：fa2104万分之一电子天平(上海天平制造)；au-220万分之一电子天平(日本岛津公司)；超声仪(天津奥特赛恩斯精密仪器公司)；lc-20at高效液相色谱仪、spd-20a检测器(日本岛津公司)；waterse2695高效液相色谱仪、2998pda检测器(美国沃特世公司)。
试药：甲醇为分析纯(上海苏懿化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯(瑞典欧森巴克环境化学公司)；磷酸为分析纯(上海苏懿化学试剂有限公司)；超纯水为纯水机自制；温胃舒颗粒(批号：1703020、1703005、1702021、1702013、1702006、1702001、1701015、1701008、1701006、1701003)。
实施例1：供试品溶液的制备
1、提取溶剂的考察
取温胃舒颗粒样品(批号：1706005)7.5g，3份，分别置150ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇、75％甲醇、50％甲醇25ml超声30min，进样，记录色谱图。放至室温，过0.45μm的滤膜，取续滤液即得。
结果表明，从色谱图和峰面积结果看出，不同浓度的甲醇色谱图相近，甲醇提取较完全，主要色谱峰峰面积较大，因此选择甲醇作为提取溶剂。
2、提取时间的考察
取同一批温胃舒颗粒样品7.5g，3份，分别置150ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml分别超声30min、45min、60min，放至室温，过0.45μm的滤膜，取续滤液即得。比较不同提取时间单位质量的峰面积差异。
结果表明色谱峰信息及单位质量的主峰峰面积无明显差异，说明超声提取30min可将主要成分提取完全，因此选择甲醇超声提取30min。
实施例2：色谱条件优化
1、检测波长的考察
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相a，0.1％磷酸水溶液为流动相b；检测波长以246nm为基本条件对梯度洗脱程序进行探索，同时考察232nm和212nm波长下的色谱图情况。3种波长下232nm和212nm的色谱信息较丰富，但末端吸收212nm基线波动较大，因此综合选择232nm作为检测波长。
2、洗脱梯度考察
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相；柱温：30℃，检测波长232nm，进样量10μl为基本条件对梯度洗脱程序进行优化，优选出最佳的洗脱梯度为：
实施例3：温胃舒颗粒指纹图谱方法学验证
1、指纹图谱检测
按照优化后的检测条件进行温胃舒颗粒指纹图谱检测，具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取温胃舒颗粒粉末，精密称取7.5g，加入25ml的体积浓度100％的甲醇溶液，超声处理30min，放冷，过滤，取续滤液即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成0.1mg/ml的对照品溶液作为参照物溶液。另取补骨脂素、异补骨脂素适量分别加甲醇制成0.025mg/ml的对照品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a、以体积分数为0.1％的磷酸水溶液为流动相b按照如下程序进行梯度洗脱：
0min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
0-5min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
5min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
5-20min，流动相a所占体积由15％逐步递增至25％，余量为流动相b；
20min，流动相a所占体积为25％，余量为流动相b；
20-45min，流动相a所占体积由25％逐步递增至45％，余量为流动相b；
45min，流动相a所占体积为45％，余量为流动相b；
45-50min，流动相a所占体积由45％逐步递增至80％，余量为流动相b；
50min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
50-55min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
55min，流动相a所占体积为80％，余量为流动相b；
55-60min，流动相a所占体积由80％逐步递减至15％，余量为流动相b；
60min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
60-65min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b；
65min，流动相a所占体积为15％，余量为流动相b。
检测波长为230-235nm；柱温25-40℃；流速为0.5-1.5ml/min。
(4)分别精密吸取供试品及对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的色谱图；
(5)检测所得的温胃舒颗粒的指纹图谱中，共有峰为：1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰橙皮苷、6号峰、7号峰、8号峰补骨脂素和9号峰异补骨脂素；以5号峰为内参照峰，各峰号的相对保留时间分别为：1号峰0.433、2号峰0.479、3号峰0.533、4号峰0.892、5号峰1.000、6号峰1.365、7号峰1.578、8号峰1.629和9号峰1.696。其中5号峰为橙皮苷峰，8号峰为补骨脂素峰，9号峰为异补骨脂素峰。
2、精密度试验
取同一批温胃舒颗粒样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，考察各共有峰与内标峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表1和2所示。
表1精密度试验-相对保留时间
表2精密度试验-相对峰面积
结果表明，相对保留时间rsd<2％，相对峰面积rsd<3％。
3、重复性试验
取同一批号的样品6份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定色谱图，结果见表3和4。
表3重复性试验-相对保留时间
表4重复性试验-相对峰面积
结果表明，各共有色谱峰的相对保留时间rsd<2％，相对峰面积rsd<3％。
4、稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h、24h进行检测，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积，结果见表5和6。
表5稳定性试验-相对保留时间
表6稳定性试验-相对峰面积
结果表明，24h内各共有色谱峰的相对保留时间rsd<2％，相对峰面积rsd<3％。
实施例4：温胃舒颗粒指纹图谱的构建和相似度评价
按如下方法建立温胃舒颗粒的指纹图谱：
取温胃舒药物制剂对照品橙皮苷对照品溶液和补骨脂素、异补骨脂素对照品溶液、以及10个批次经现行标准检测合格的温胃舒颗粒粉末(批号：1703020、1703005、1702021、1702013、1702006、1702001、1701015、1701008、1701006、1701003)制备供试品溶液，按照实施例3的方法建立温胃舒颗粒的指纹图谱。
对照品溶液的液相色谱图、10批供试品溶液色谱图导入指纹图谱相似度计算软件后导出的叠加色谱图和建立的温胃舒颗粒的指纹图谱分别如附图4和附图5.
采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件中“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，生成对照指纹图谱。
由图5可知，温胃舒颗粒的指纹图谱中有9个共有特征峰，依次标号为1、2、3、4、5、6、7、8、9，经过对照品溶液比对，其中5号峰为橙皮苷，8号峰为补骨脂素，9号峰为异补骨脂素。选取其中的5号峰作为内参照峰(s峰)，以参照峰的相对保留时间为1，计算其他各峰的相对保留时间，结果见表7。
采用药典委员会规定中药色谱指纹图谱相似度评价系统对图谱进行综合评价，与对照指纹图谱相似度结果见表8。
表710批温胃舒颗粒共有峰相对保留时间
表8相似度结果
从表7的相似度结果中看出，10温胃舒颗粒样品与参照谱以及根据中位数法生成的对照谱之间的相似度均大于0.9，表明不同批次的温胃舒颗粒的相似度较好。将温胃舒颗粒指纹图谱纳入其质量评价中，将其相似度定为不低于0.9。
实施例5：
本实施例构建温胃舒颗粒的指纹图谱的方法与实施例3的区别仅在于：供试品溶液的制备步骤中，称取8.0g的温胃舒颗粒，其余实验条件和实验操作均与实施例3相同。
实施例6：
本实施例构建温胃舒颗粒的指纹图谱的方法与实施例3的区别仅在于：供试品溶液的制备步骤中，提取超声时间为45min，其余实验条件和实验操作均与实施例3相同。
实施例7：
本实施例构建温胃舒颗粒的指纹图谱的方法与实施例3的区别仅在于：供试品溶液的制备步骤中，提取超声时间为60min，其余实验条件和实验操作均与实施例3相同。
实施例8：温胃舒颗粒的质量检测
样品批号：1706005、1705001
供试品溶液制备：称取上述两个批号的温胃舒颗粒10.0g，加入50ml甲醇，超声处理30min，冷却后过滤，所得滤液即为供试品溶液。
对照品溶液制备：称取橙皮苷对照品、补骨脂素、异补骨脂素对照品分别配置成浓度为溶液的浓度为0.1mg/ml、0.025mg/ml、0.025mg/ml的对照品溶液。
色谱条件：同实施例3。
分别精密吸取等量的供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件记录65min，即得各供试品溶液和对照品溶液的液相色谱图。采用药典委员会规定中药色谱指纹图谱相似度评价系统对图谱进行评价，计算与对照指纹图谱的相似度并在待测样品中找到与指纹图谱对应的9个特征峰。以对照品橙皮苷保留时间为1计算其他特征峰的相对保留时间，计算结果如表9所示。
表9批号为1706005、1705001样品的特征峰的相对保留时间和指纹图谱相似度
表9可知，批号为1706005、1705001样品的特征峰的相对保留时间均在规定的保留时间范围内，相似度＞0.9，说明该两批温胃舒颗粒的质量符合要求。