专利名称：一种魔芋指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种魔芋指纹图谱的建立方法。 技术背景指纹图谱的研究开发与应用始于对中药材产品质量的监控。中药指纹图谱是 借鉴法医学"指纹"的概念，包括中药DNA指纹图谱、蛋白质指纹图谱和化学指 纹图谱等。我们所说的指纹图谱是指化学指纹图谱。指纹图谱有两个特点 一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪 或产地；二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的 质量，确保产品质量的相对一致。目前，指纹图谱己成为国际公认的控制中药或 天然药物质量的最有效的手段，但魔芋的化学指纹图谱方面的研究目前尚未见报 到。发明内容-本发明的目的是为建立魔芋指纹图谱提供一种新的方法，并由此方法得到 魔芋的指纹图谱。为达到本发明的目的所采用的技术方案用高效液相色谱法建立魔芋指纹 图谱的方法，具体包括如下步骤(a) 试样的制备取魔芋组织杀青烘干，研碎，称样于试管中，用纯净水 定容，过滤，按照植物氨基酸的分析方法，对试样进行衍生；(b) 色谱条件用高效液相色谱仪或氨基酸分析仪，流动相A为乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B:乙腈，流动相C:超纯水；柱温37。C，流速0. 5-1. 2mL/min; 检测波长230-260腦；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；(C)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。进一步优选的方法可以通过下述步骤实施(a)试样的制备取魔芋组织杀青烘千，研碎，称取于试管中，用纯净水定 容，过滤，按照植物氨基酸的分析方法，对试样进行柱前衍生；(b)色谱条件色谱柱为美国Waters公司提供的U柱流动相A为pH=4. 95 的140mM乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B: 100%乙腈，流动相C: 100%超纯水； 柱温37。C，流速1. 0-1. 2mL/min;检测波长248咖；(d)测定精密吸取供试品溶液O. 1 25yl注入高效液相色谱仪，按照高效 液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施(a) 试样的制备取魔芋组织于115'C杀青10min， 8(TC烘干，研碎，称取 0. 5000g于试管中，加纯净水10mL，于80"C干燥箱中保温12小时，取出，用纯 净水定容至10mL，滤纸过滤后，溶液用0.45iim滤膜过滤，按照植物氨基酸的 分析方法，对试样进行柱前衍生；(b) 色谱条件用高效液相色谱仪或氨基酸分析仪，流动相A为pH=4. 95的 140mM乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B: 100%乙腈，流动相C: 100%超纯水；柱 温37。C，流速1. 0-1. 2mL/min;检测波长248歷；色谱柱以十八垸基硅垸键合 硅胶为填料；(c) 测定精密吸取供试品溶液8y l注入高效液相色谱仪，按照高效液相 色谱法测定，得到指纹图谱。本发明可以根据通过分析指纹图谱中特征峰与魔芋品种、品质、抗性、产量、 生长状况等的关系，为魔芋资源收集整理、分类、新品种选育、研究新型氨基酸 农药防治魔芋病害等科研工作提供技术指导。
下面结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。 附图1为正常花魔芋的指纹图谱； 附图2为软腐病花魔芋的指纹图谱； 附图3为白魔芋的指纹图谱； 附图4为珠芽魔芋的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明本发明的实施实例1:(a) 试样的制备取正常花魔芋(Normal A.Konjac)、软腐病株花魔芋 (Erwinia carotvora A. Konjac)、白魔芋(Normal A. albus)、珠芽魔芋(NormalA. bulbifer)叶片于115。C杀青10min， 80。C烘干，研碎，称取0. 5000g于试管 中，加纯净水10mL，于8(TC干燥箱中保温12小时，取出，用纯净水定容至10mL， 滤纸过滤后，溶液用0. 45 u M滤膜过滤，用AccQ. Tag法测定水溶性氨基酸含量；(b) 色谱条件用美国Waters 2695分离单元+2996 二极管矩阵检测器； Milli-Q超纯水器(美国Milli-Q公司)；KQ-50B超声波清洗器；真空干燥箱； 17种氨基酸标样(Waters公司提供)；乙腈(色谱纯，天津福晨)，甲醇(色 谱纯，天津福晨)，乙酸钠一三乙胺缓冲液(Waters公司提供，使用时以1: 10稀释，超声波脱气lmin);流动相A: 140mM乙酸钠-三乙胺缓冲液(pH4. 95)， 流动相B: 100%乙腈;柱温37。C流速1.2mL/min;色谱柱美国Waters Atlantis C18柱(4.6X150腿，4um)，梯度程序0min: 100%A; 0,5min， 97%A+3%B; 15min， 96%A+4%B; 33min， 60%B+40%H20; 35min， 100%A;运行时间40min;(c)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法 测定，得到指纹图谱。附图1为正常花魔芋的指纹图谱；附图2为软腐病花魔芋的指纹图谱；附图3为白魔芋的指纹图谱；附图4为珠芽魔芋的指纹图谱。实施实例2 其制作步骤为(a)试样的制备取魔芋叶片于115t:杀青10miri， 8(TC烘干，研碎，称取 0.5000g于试管中，加纯净水10mL，于80'C干燥箱中保温过夜，取出，用纯净 水定容至10mL，滤纸过滤后，溶液用0. 45um滤膜过滤，采用Waters公司1994 年推出的AQC法，即准确吸取供试样品10ul于衍生管中，加入缓冲液70yl， 再在涡旋搅拌器上边搅拌边加入10 u 1衍生剂，混匀，于6(TC烘箱中保温10min， 取出，转入进样小瓶中，待测；(b)色谱条件仪器为美国Waters 2695分离单元+2996 二极管矩阵检测器， 流动相A为140rnM乙酸钠-三乙胺缓冲液(pH4.95)，流动相B: 100%乙腈，流 动相C: 100%超纯水；柱温37。C，流速1.0-1.2mL/min;检测波长248nm;色 谱柱为美国Waters公司提供的C,s柱(4.6X150ram， 4um);(c)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法 测定，得到指纹图谱。AccQ. Tag法是1994年由Waters公司推出的柱前衍生测定氨基酸的方法， 其原理是6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)与氨基酸分子上 的氨基反应生成具有荧光和紫外吸收的物质，通过色谱柱分离后用荧光检测器或 紫外检测器进行检测的方法，Waters公司一般推荐使用氨基酸分析包中专用的 色谱柱，即AccQ.Tag专用柱，在多年的实践中对该方法进行了多方面的改进， 采用不同型号的色谱柱分析了不同来源样品中的氨基酸。本试验采用Waters Atlantis C18柱分析氨基酸含量，组氨酸(His)与甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)与 精氨酸(Arg)的出峰顺序与AccQ.Tag专用柱相反，氨基酸分析包中仅提供了 17 种氨基酸标样，但AccQ.Tag法能够和其他含氨基的化合物反应而被检测，具体 可正常花魔芋、白魔芋叶片的水溶性氨基酸图谱图。
权利要求
1、一种魔芋指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤(a)试样的制备取魔芋组织于杀青烘干，研碎，称取于试管中，用纯净水定容，过滤，按照植物氨基酸的分析方法，对试样进行柱前衍生；(b)色谱条件用高效液相色谱仪或氨基酸分析仪，流动相A为乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B乙腈，流动相C超纯水；柱温37℃，流速0.5-1.2mL/min；检测波长230-260nm；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；(c)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2、如权利要求1所述的魔芋指纹图谱的建立方法，其特证在于 所述步骤(b)色谱条件色谱柱为美国Waters公司提供的C,s柱流动相A为 PH=4.95的140mM乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B: 100%乙腈，流动相C: 100% 超纯水；柱温37。C，流速1.0-1.2mL/min;检测波长248nm;(d)测定精密吸取供试品溶液O. 1 25nl注入高效液相色谱仪，按照高效 液相色谱法测定，得到指纹图谱。
3、如权利要求1所述的魔芋指纹图谱的建立方法，其特证在于 所述步骤(a) 试样的制备取魔芋组织于115。C杀青10min， 8(TC烘干，研碎，称取 0. 5000g于试管中，加纯净水10mL，于8(TC干燥箱中保温12小时，取出，用纯 净水定容至10mL，滤纸过滤后，溶液用0.45um滤膜过滤，按照植物氨基酸的 分析方法，对试样进行柱前衍生；(b) 色谱条件用高效液相色谱仪或氨基酸分析仪，流动相A为pH=4. 95的 140mM乙酸钠-三乙胺缓冲液，流动相B: 100%乙腈，流动相C: 100%超纯水；柱 温37。C，流速1. 0-1. 2mL/min;检测波长248nm;色谱柱以十八烷基硅烷键合 硅胶为填料；(c)测定精密吸取供试品溶液8ul注入高效液相色谱仪，按照高效液相色 谱法测定，得到指纹图谱。
全文摘要
本发明涉及一种魔芋指纹图谱的建立方法。一种魔芋指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法包括如下步骤(a)试样的制备取魔芋组织于杀青烘干，研碎，称取于试管中，用纯净水定容，过滤，按照植物氨基酸的分析方法，对试样进行柱前衍生；(b)色谱条件用高效液相色谱仪或氨基酸分析仪，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；(c)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明可以根据通过分析指纹图谱中特征峰与魔芋品种、品质、抗性、产量、生长状况等的关系，为魔芋资源收集整理、分类、新品种选育、研究新型氨基酸农药防治魔芋病害等科研工作提供技术指导。
文档编号G01N30/06GK101251518SQ200810046880
公开日2008年8月27日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者杨朝柱, 滕建勋, 牟方贵, 陈永波, 降巧龙 申请人:恩施土家族苗族自治州农业科学院