一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法与流程

本发明涉及一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，属于谷物鉴别技术领域。

背景技术

蛋白组学作为“组学”技术(包括基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学)中的一种，用于从整体表达水平来阐明生命现象、研究生命活动的规律。与静态的基因组学研究相比，蛋白组学是具有时间性和空间性的动态的细胞动力学研究，因而这一新学科也被视为一种新的“后基因组”研究方法，用于探讨特定基因和蛋白质的相互关系以及修饰蛋白与蛋白的相互作用。近年来蛋白组学已被广泛应用于植物对环境胁迫的鉴定和追踪上。

大米是一种重要的谷物作物，尤其在亚洲地区。近年来，随着人们生活水平的逐渐提高，人们对食品安全与健康的意识也随之增强。有机农产品以其绿色健康、无公害、营养价值高等特点受到消费者的青睐。目前市场上有机农产品品种繁多，价格也明显高于普通农产品，但目前仍无全面而健全的方法对市售标有“有机食品”字样的产品进行鉴别检测。在植物发育过程中，不同种植环境条件会影响不同组织和器官功能上的分化，进而表现在其蛋白质的差异上。目前对有机农产品的检测多集中于化学检测上，这些检测方式多注重于对某一种或某一类物质的检测上，无法从更全面的角度上对有机产品进行衡量和测定。

技术实现要素：

为解决现有化学方法无法对有机大米和非有机大米方法进行快速而高效检测的问题，本发明提供了一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用蛋白组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，该方法包括如下步骤：

1)分别对有机大米样品、非有机大米样品和待检测大米进行蛋白提取，获得每个大米样品的蛋白粗提取液；

2)利用胰蛋白酶分别对每个大米样品的蛋白粗提取液进行酶解，获得大米样品的酶解液；

3)利用毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱分别对大米样品酶解液中的酶解产物进行分离和鉴定，获得大米样品的蛋白信息；

4)将有机大米样品的蛋白信息和非有机大米样品的蛋白信息进行缺失筛选，得到有机大米和非有机大米的差异蛋白；

5)根据有机大米样品和非有机大米样品的差异蛋白在其酶解液中的含量数据建立偏最小二乘-判别分析模型；

6)将待检测大米样品在其酶解液中的含量数据带入最小二乘-判别分析模型中，并且对样品参考值进行定义：1为是，0为否，经过偏最小二乘-判别分析模型分析获得待检测大米样品的样品计算值；通过待测大米样品计算值判定待检测大米样品为有机大米或非有机大米；当样品计算值在小于0.5时被认定为否，当样品计算值大于0.5时被认定为是。

优选地，步骤1)所述蛋白提取是将大米用液氮研磨成粉末，按液质比10:1的比例加入std缓冲液，混匀后沸水浴，并进行超声破碎，超声破碎完成后再次沸水浴，离心取上清得蛋白粗提取液；所述std缓冲液的配方为：4％(w/v)sds，1mmdtt，150mmtris-hcl，ph8.0。

更优选地，所述超声破碎是在80w下超声10次，每次超声10s，间歇15s。

优选地，步骤2)是利用fasp法对蛋白粗提取液进行酶解，具体为：向步骤1)获得的蛋白粗提取液中加入dtt，沸水浴后冷却至室温，加入ua缓冲液混匀，转入超滤离心管中离心，离心完成后向沉淀中加入iaa，振荡混匀，避光室温静置后离心；向沉淀中加入ua缓冲液，离心；向沉淀中加入nh4hco3，离心；最后向沉淀中加入胰蛋白酶缓冲液，过夜水解离心后收集滤液，得酶解液。

更优选地，步骤2)是取200μg蛋白粗提取液，向蛋白粗提取液中加入dtt至dtt的终浓度为100mm，沸水浴后冷却至室温，加入200μlua缓冲液混匀，转入超滤离心管，离心后加入200μlua缓冲液，离心后弃滤液，向沉淀中加入100μliaa溶液，振荡，避光室温30min后离心，向沉淀中加入100μlua缓冲液后离心，重复该步骤两次，加入100μl100mmnh4hco3后离心，重复该步骤2次；加入40μl胰蛋白酶缓冲液，振荡后于37℃过夜水解，离心后收集滤液，得酶解液；其中：ua缓冲液的配方为：8m尿素，150mmtris-hcl，ph8.0；所述胰蛋白酶缓冲液是通过将2μg胰蛋白酶溶于40μl25mmnh4hco3中制备的；所述iaa溶液是通过将50mmiaa溶于100μlua缓冲液制备的。

优选地，步骤3)所述毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱中毛细管液相色谱采用rp-c18色谱柱，流动相采用流动相a和流动相b，其中：流动相a为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为0.1％(v/v)甲酸-乙腈水溶液。

优选地，所述毛细管液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0-15min，4％-50％流动相b，50-54min，50％-100％流动相b，54-60min，100％流动相b，60-61min，100％-4％流动相b，61-65min，4％流动相b。

优选地，步骤3)所述毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱的质谱条件为：分析时长：60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000，agctarget：3e⁶，一级maximumit：10ms，扫描次数：1次，dynamicexclusion：40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱ms2scan，ms2activationtype：hcd，isolationwindow：2m/z，二级质谱分辨率：17,500，microscans：1，二级maximumit：60ms，normalizedcollisionenergy：30ev，underfillratio：0.1％。

优选地，步骤1)所述有机大米样品、非有机大米样品均已被认证。

优选地，步骤5)所述偏最小二乘-判别分析模型的校验方法为：选择待测的有机大米和非有机大米，分别对每个的待测大米样品进行蛋白提取，获得蛋白粗提取液；利用胰蛋白酶分别对蛋白粗提取液进行酶解，获得大米样品的酶解液；利用毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱分别对大米酶解产物进行分离和鉴定，获得有机大米、非有机大米的蛋白信息；将待检测大米样品的在其酶解液中的含量数据带入最小二乘-判别分析模型中，并且对样品参考值进行定义：1为是，0为否，经过偏最小二乘-判别分析模型分析获得待检测大米样品的样品计算值；根据样品计算值对待检测大米样品进行判定；将判定结果与真实情况相比较，当误判率为0时判定为建立的偏最小二乘-判别分析模型能够用于对有机大米和非有机大米进行鉴别。

本发明将蛋白组学应用到有机大米的鉴别当中，利用nanolc-ms/ms法对大米蛋白提取物进行分离和定量，并利用数据库对质谱信息进行识别。

本发明方法区分待检测大米的方法是：在模型建立后，将进行模型验证(预测)步骤。在验证步骤中，首先对样品参考值进行定义，即1为是，0为否，进而对识别进行定义，即样品计算值在小于0.5时被认定为否，样品计算值大于0.5时被认定为是。预测结果(即样品计算值)是将待检验的样品按照实验步骤进行测定，将数据经预处理和缺失筛选后带入到已建立好的模型进行计算得到的。

本发明有益效果：

(1)应用了蛋白组学技术，利用毛细管色谱串联高分辨质谱技术对大米蛋白提取物进行分析，信服力高。非靶向蛋白组学技术可以对样品蛋白的整体情况进行研究，可以反映出植物在受种植条件影响下所产生的翻译和转录的整体情况，同时，统计学模型的建立为进一步的鉴别应用提供技术支持。

(2)采用本发明的分析方法能够有效区分有机大米和非有机大米，结果以pls-da模型验证值体现，能够直观的判别其分类情况，检测结果准确可靠。

(3)简化操作流程：传统的检测需要配置标准样品，绘制标准曲线，同时需要对多种化学物质进行测定，过程繁琐，费时费力。应用非靶向的蛋白组学方法进行测定，操作方便，上机操作也比较便捷，可以进行批量处理，省时省力，可信度高。

(4)针对利用毛细管液相色谱串联高分辨质谱法区分有机大米和非有机大米的分析方法，本发明根据大米样品的蛋白特点，优化筛选得到一组使得大米蛋白提取物得到最佳分离效果和检测效果的毛细管液相色谱条件以及高分辨质谱的工艺条件，经过试验验证，通过该工艺条件，能够在pls-da得分图上将有机大米与非有机大米有效区分。

(5)pls-da模型的基础上，本发明将待检测样品带入已建立的模型当中进行验证和预测，利用所得到的样品计算值可对检测样品进行区分和判断，正确率高，可信度高。

(6)本发明使用了高分辨质谱，与其他的检测方法相比，可以得到更为准确且全面的样品蛋白信息，这在后续分析和鉴别中具有显著的优势。

附图说明

图1为蛋白组学分析技术路线图。

图2为大米蛋白在不同肽段范围内的分布。

图3为大米样品差异性蛋白火山图。

图4为大米差异性蛋白hca图。

图5为大米蛋白组学pls-da模型得分图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用的仪器与设备如下：

q-exactive质谱仪(thermofinnigan)；easynlc1000纳升级液相色谱仪(thermofinnigan)；低温高速离心机(eppendorf5430r)；600v电泳仪(gehealthcareeps601)；色谱上样柱thermoscientificeasycolumn(200mm×100μm，5μm-c18)；色谱分析柱thermoscientificeasycolumn(100mm×75μm，3μm-c18)。

以下实施例中所涉及的材料与试剂如下：

甘油(g0854，上海生工)；溴酚蓝(161-0404，上海生工)；sds(161-0302，bio-rad)；urea(161-0731，bio-rad)；trisbase(161-0719，bio-rad)；dtt(161-0404bio-rad)；iaa(163-2109bio-rad)；kh2po4(10017618，国药试剂)；kcl(10016318，国药试剂)；hcl(10011018，国药试剂)；nh4hco3(a6141，sigma)；acetonitrile(i592230123，merck)；超滤离心管(10kd，sartorius)；5×上样缓冲液(10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油，500mmdtt，250mmtrishcl，ph6.8)；sdt缓冲液(4％sds，100mmtris-hcl，1mmdtt，ph7.6)；ua缓冲液(8murea，150mmtris-hcl，ph8.0)。

以下实施例中所涉及的定义和缩写对照如下：

sds，十二烷基磺酸钠

dtt，二硫苏糖醇

tris-hcl，三羟甲基氨基甲烷缓冲液

fasp，超滤管酶解法

iaa，碘乙酰胺

hca，聚类分析

pls-da，偏最小二乘-判别分析

实施例1：

一、实验方法(技术路线图如图1所示)

1、样品

实验选择26个大米样品，其中有机大米样品13个，普通大米13个。按照kennard-stone算法将每种大米样品随机按3:1的比例分为校正集(10个)和验证集(3个)。

2、蛋白提取

样品用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，按10：1加入stdbuffer(4％sds，1mmdtt，150mmtris-hcl，ph8.0)，votex混匀，沸水浴5min。超声破碎(80w，超声10s，间歇15s，共10次)沸水浴5min，离心取上清，获得蛋白粗提取液。用bca法检测蛋白粗提取液中总蛋白质的含量，取约20μgsds-page电泳检测，经过电泳检测若蛋白能够分离的用于后续实验。

3、fasp酶解

取200μg蛋白粗提取液，加入dtt至dtt终浓度为100mm，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μlua缓冲液(8murea，150mmtris-hcl，ph8.0)混匀，转入10kd超滤离心管，离心14000×g10min。再次加入200μlua缓冲液离心14000×g10min，弃滤液。加入100μliaa溶液(50mmiaa溶于100μlua缓冲液)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000×g10min，重复该步骤2次。加入100μl25mmnh4hco3，离心14000×g10min，重复该步骤2次。加入40μl胰蛋白酶缓冲液(4μl胰蛋白酶溶于40μlnh4hco3)，600rpm振荡1min，37℃过夜水解，换新收集管，离心14000×g10min，收集滤液，进行nanolc-ms/ms分析。

4、毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱分析

液相a液为0.1％(v/v)甲酸水溶液，b液为0.1％(v/v)甲酸乙腈水溶液。上样到thermoscientificeasycolumn(20mm×100μm,5μm-c18)色谱柱，以95％的a液平衡。再经分析柱thermoscientificeasycolumn(100mm×75μm,3μm-c18)进行分离，流速为250μl/min，相关液相梯度如表1。酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用qexactive质谱仪(thermofisher)进行质谱分析。质谱分析条件为：分析时长：60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000，agctarget：3e⁶，一级maximumit：10ms，扫描次数：1次，dynamicexclusion：40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(ms2scan)，ms2activationtype：hcd，isolationwindow：2m/z，二级质谱分辨率：17,500，microscans：1，二级maximumit：60ms，normalizedcollisionenergy：30ev，underfillratio：0.1％。

表1流动相梯度

5、数据处理

质谱分析原始数据为raw文件，用软件mascot2.2(uniprotoryzasativa蛋白质库，收录序列168272条，下载于20180418)和maxquant进行查库鉴定及定量分析，最后得到鉴定的蛋白质结果。查库时将raw文件通过maxquant提交至mascot服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。相关参数如下表2。

表2mascot搜索参数

对经过识别的蛋白进行缺失筛选，对筛选出的共性蛋白进行差异性分析，以差异倍数和p值作为衡量标准，选择有机大米和非有机大米的差异性蛋白。最后利用多元统计分析方法偏最小二乘-判别分析模型对有机大米和非有机大米进行建模，在评价模型指标后利用验证集中的样品带入模型进行验证。

二、实验结果

1、肽段的检测结果

通过ms/ms数据进行查库所得结果获得如图2所示的肽段的检测结果，由图2可知：20个大米蛋白样品所检测出的肽段总数量略有差异，但整体肽段分子量分布趋势相似，样品蛋白的相对分子质量主要集中在0-40kda之间，占全部蛋白质总数的60％以上，其中分布最为密集的区间为20-40kda，约占全部蛋白质总数的30-35％。

2、差异性蛋白筛选

对20个样本中的1661个蛋白进行缺失筛选，对20组数据中都检测到的蛋白进行采集，共筛选出418个共性蛋白。利用两组样本间的蛋白质表达差异倍数(foldchange)和t检验得到的p-value两个因素共同绘制火山图(volcanoplot)，如图3所示，用于显示两组大米样本数据的著性差异。横坐标为倍图(以2为底的对数变换)，纵坐标为差异的显著性p-value(以10为底的对数变换)。选取fc＞1.5或者fc＜0.667，p-value＜0.05的蛋白作为差异蛋白。通过火山图筛选出差异性共有蛋白114个，其中58下调蛋白，56个上调蛋白。

利用该114个差异蛋白进行聚类分析(hca)，获得如图4所示的大米差异性蛋白热点图(heatmapimage)。由图4可以看出，图中颜色越靠近红色，代表丰度上升倍数越大，越靠近绿色，代表丰度下降倍数越大。热点图可将上调与下调蛋白可视化，并以此为依据进行初步分类。

3、模型的建立与验证

对114个差异性蛋白进行pls-da建模，得到如图5所示的大米蛋白组学pls-da模型得分图，从pls-da得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中10个有机大米样品全部集中在x轴负半轴(方块)，而10个非有机大米样品全部集中在x轴正半轴(圆点)。

模型对样品分离程度较好，利用验证集中的6个大米样品对模型进行带入验证，得到每个样品的拟合值如表3所示。

表3pls-da模型对水稻样品的预测结果

判定方法：将待检测大米的差异蛋白的含量数据带入偏最小二乘-判别分析模型分析会获得一对大米样品计算值，每对计算值包括一个待测样品在有机大米组中的拟合值以及一个待测样品在非有机大米组中的拟合值。对该组计算值进行评价，当该样品在有机大米组中的拟合值小于0.5时被认定为不是有机大米样品，有机大米样品拟合值大于0.5时被认定为是有机大米样品；当该样品在非有机大米样品组中的拟合值大于0.5时被认定为是非有机大米样品，非有机大米样品拟合值小于0.5时被认定为是有机大米样品。

经验证，全部大米样品都可被成功识别，误判率为0。说明利用蛋白组学法结合化学计量分析所建立的pls-da模型对有机大米和非有机大米进行鉴别有很好的效果。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。