天然植物抗球虫饲料添加剂的薄层色谱鉴别方法与流程

本发明涉及薄层色谱检测技术，具体地说，涉及天然植物抗球虫饲料添加剂的薄层色谱鉴别方法。

背景技术

在禽类养殖中，球虫病是严重危害养殖业的疾病之一，该病的发生率极高，分布范围广，其病死率可达40％～80％。爱绿爽是北京爱绿生物科技有限公司生产的一种安全高效、无残留、不易产生耐药性的抗球虫饲料添加剂(参见zl201410832060.x，发明名称：一种天然植物抗球虫饲料添加剂及其应用)。该饲料添加剂能有效抑杀球虫的孢子、第一代及第二代裂殖体，降低其发病率及避免发病区域继续扩大；同时提高机体免疫与抗病力，降低病原球虫对机体的侵染；保护和修复受损胃肠粘膜，促进营养物质的吸收，具有抑杀球虫、增强免疫力、修复胃肠道三重功效，该产品绿色环保，适合在畜牧业领域大力推广。

为保护广大消费者的利益，打击不法销售现象，开发一种简便快速的鉴别爱绿爽产品真伪的方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供天然植物抗球虫饲料添加剂的薄层色谱鉴别方法。

本发明构思如下：天然植物抗球虫饲料添加剂(爱绿爽产品)中，含有黄芪提取物、青蒿提取物、常山提取物、仙鹤草提取物、杜仲提取物、蒲公英提取物、苍术提取物、桑叶提取物、芦荟提取物、陈皮提取物、山楂提取物、甘草提取物等，根据产品抗球虫机理，其中有效成分主要为橙皮苷(原药材陈皮)、咖啡酸(原药材蒲公英)、绿原酸(原药材蒲公英)、芦荟苷(原药材芦荟)、黄芪甲苷(原药材黄芪)、青蒿素(原药材青蒿)、常山碱(原药材常山)、甘草酸(原药材甘草)等，上述8种成分的理化特性有所不同，其中橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷等4种成分理化性质相近，在现有的薄层鉴别法中采用相似的前处理方法和展开系统，由此将这4种成分作为爱绿爽产品的特征成分进行检测。

为了实现本发明目的，本发明提供的天然植物抗球虫饲料添加剂的薄层色谱鉴别方法，包括以下步骤：

1)对待测样品进行前处理得到供试品溶液；

2)分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液；

3)将上述供试品溶液和对照品溶液依次点样于同一薄层板的同一水平线的不同位置上，然后将薄层板置于展开剂中上行展开，展距13-15cm，结束展开；

4)取出薄层板，晾干后喷以显色剂进行显色，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

本发明中采用体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水作为展开剂。

前述的方法，步骤1)具体为：取待测样品1-2g，加入甲醇10-20ml溶解，超声处理15-20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇1-2ml溶解，作为供试品溶液；其中，超声条件为40-60w，35-45hz。优选地，取待测样品2g，加入甲醇20ml溶解，超声处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；其中，超声条件为60w，45hz。

前述的方法，步骤2)所述对照品溶液为橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷的甲醇溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

步骤1)和2)中优选以甲醇为溶剂。

前述的方法，步骤3)中点样量为：供试品溶液及对照品溶液各5-10μl。优选地，点样量为：供试品溶液10μl，橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液各10μl、10μl、5μl、10μl。

优选地，步骤3)中展开的条件为：温度20-30℃，湿度35-65％，优选温度24℃、湿度50％。

前述的方法，步骤4)中使用的显色剂为1％氯化铝溶液、2％三氯化铁乙醇溶液、碘化铋钾溶液或氨蒸气。优选1％氯化铝溶液。

优选地，步骤4)具体为：晾干的薄层板喷以1％氯化铝溶液，加热(优选105℃)至斑点清晰，置于紫外365nm下检视。

本发明中，所述天然植物抗球虫饲料添加剂由如下重量份的原料制得：黄芪提取物50-100份、青蒿提取物50-150份、常山提取物50-150份、仙鹤草提取物50-100份、杜仲提取物50-100份、蒲公英提取物50-100份、苍术提取物50-100份、桑叶提取物50-100份、芦荟提取物50-100份、陈皮提取物50-100份、山楂提取物50g-100份、甘草提取物50-100份。

步骤4)中显色结果的判定标准为：如果在与各对照品溶液相同rf位置处显示斑点，且与所述天然植物抗球虫饲料添加剂标准品所示色谱斑点带型一致，则判定待测样品为天然植物抗球虫饲料添加剂产品，若在上述rf位置处未显示相应斑点，且与所述天然植物抗球虫饲料添加剂标准品所示色谱斑点带型不一致(即，不含4处特征斑点和/或条带上具有未知光点的为伪品)，则判定待测样品不是天然植物抗球虫饲料添加剂产品。在本发明的一个具体实施方式中，所述薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

①取待测样品2g，加入甲醇20ml溶解，超声处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；其中，超声条件为60w，45hz；

②以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml；

③用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上；

④将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后(预饱和目的是为营造利于展开的环境，使条带走得更顺畅、更笔直；不够饱和情况下，条带可能会走歪，影响实验结果)，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开；

⑤取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。其中，橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对应的rf值分别为0.38、0.69、0.23、0.58。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次采用薄层色谱法鉴别天然植物抗球虫饲料添加剂(爱绿爽产品)，该方法操作简单，重复性好，可信度高，便于药材加工、销售企业和药品检验单位推广应用。

附图说明

图1-3分别为本发明实施例1-3中薄层色谱检测结果。

图4和图5为本发明实施例4中不同展开剂条件下薄层色谱检测结果。

图6-9分别为本发明实施例5-8中薄层色谱检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中硅胶g薄层板购自烟台市化学工业研究所，品牌：银龙牌，型号：hsg，100×200mm。实施例2和3的爱绿爽产品分别对应于zl201410832060.x实施例2和3中制备的饲料添加剂，其余实施例的爱绿爽产品对应于zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂，上述产品由北京爱绿生物科技有限公司提供。

实施例1爱绿爽产品的薄层色谱鉴别方法

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图1所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。而不含上述4处特征斑点和/或条带上具有未知光点的为伪品。其中，橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对应的rf值分别为0.38、0.69、0.23、0.58。

实施例2爱绿爽产品的薄层色谱鉴别方法

检测对象：zl201410832060.x实施例2中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图2所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。其中，橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对应的rf值分别为0.29、0.67、0.21、0.56。

实施例3爱绿爽产品的薄层色谱鉴别方法

检测对象：zl201410832060.x实施例3中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图3所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。其中，橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对应的rf值分别为0.35、0.71、0.27、0.60。

实施例4不同展开剂条件下薄层色谱效果比较

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

(一)以体积比5:1的氯仿-水作为展开剂

薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品，同实施例1)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为5:1的氯仿-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距13cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图4所示，薄层板上从左至右依次为供试品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品。从图4可以看出，由于展开剂中不含有甲醇，极性较小，故最左边供试品条带展距小，成分斑点无法完全分离。而且橙皮苷、芦荟苷显色不明显，肉眼不可见。

(二)以体积比10:5:2的氯仿-甲醇-水作为展开剂

薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:2的氯仿-甲醇-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图5所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品。从图5可以看出，由于展开剂中未使用甲酸进行极性微调，故最左边供试品条带有拖尾现象。而且芦荟苷显色不明显，肉眼不可见。

爱绿爽产品中，含有黄芪提取物、青蒿提取物、常山提取物、仙鹤草提取物、杜仲提取物、蒲公英提取物、苍术提取物、桑叶提取物、芦荟提取物、陈皮提取物、山楂提取物、甘草提取物，其中有效成分主要包含多糖类、有机酸类、蒽醌类和黄酮类化合物等，根据薄层鉴别的相似相溶原理，应使用极性中等的展开系统为宜。故选择氯仿-水系统展开；在实验过程中发现，部分斑点有重叠现象，考虑加大系统极性，故优化为氯仿-甲醇-水系统展开；进一步实验发现，部分斑点有拖尾现象，考虑使用该系统会使有机酸成分展开效果不佳，故添加微量甲酸溶剂进行调整，优化为氯仿-甲醇-甲酸-水系统。经大量实验后，选择斑点清晰、显色度好、分离度高、无拖尾现象的展开系统作为最终展开剂，展开剂比例最终优化为氯仿-甲醇-甲酸-水体积比10:5:0.1:2。

实施例5不同前处理条件下(溶剂变为乙醇)薄层色谱效果比较

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入乙醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入乙醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以乙醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图6所示，薄层板上从左至右(泳道1-5)依次为供试品、橙皮苷对照品(橙皮苷对照品未显色)、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。

从图6可看出，使用乙醇做前处理溶剂时，橙皮苷不显色，表明用乙醇无法达到甲醇的显色效果。

实施例6不同前处理条件下(甲醇用量改变)薄层色谱效果比较

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇10ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图7所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。

从图7可看出，当甲醇溶剂添加量为10ml时，图谱条带显色效果与添加20ml时基本一致，表明使用10ml甲醇溶剂进行前处理，适用于本发明。

实施例7不同前处理条件下(超声时间改变)薄层色谱效果比较

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)2g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理15分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图8所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。

从图8可看出，当超声时间为15min时，图谱条带显色效果与超声时间20min时基本一致，表明前处理超声时间15min，适用于本发明。

实施例8不同取样量时薄层色谱效果比较

检测对象：zl201410832060.x实施例1中制备的饲料添加剂。

本实施例中薄层色谱鉴别方法包括以下步骤：

1、制备供试品溶液：取待测样品(爱绿爽产品)1g，加入甲醇20ml溶解，超声(60w，45hz)处理20分钟，滤过，收集滤液，将滤液蒸干，向残渣中加入甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

2、制备对照品溶液：以甲醇为溶剂分别配制橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液，浓度分别为1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml。

3、用定量毛细管分别吸取上述供试品溶液和橙皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦荟苷对照品溶液10μl、10μl、10μl、5μl、10μl依次点样于同一硅胶g薄层板的同一水平线的不同位置上。

4、将体积比为10:5:0.1:2的氯仿-甲醇-甲酸-水展开剂置于双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中，然后将点样后的薄层板置于双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10-30分钟后，将上述双槽色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有薄层板的第二个槽中，于24℃、湿度50％条件下进行展开，展距15cm，结束展开。

5、取出薄层板，晾干后喷以1％氯化铝溶液，105℃加热至斑点清晰，然后置于紫外365nm下检视，根据显色结果判定待测样品是否为天然植物抗球虫饲料添加剂产品。

检测结果如图9所示，薄层板上从左至右依次为供试品、橙皮苷对照品、咖啡酸对照品、绿原酸对照品和芦荟苷对照品。若待测样品具有该4处特征斑点，且与供试品所示色谱斑点带型一致，则判断该待测样品为爱绿爽产品。

从图9可看出，当供试品取样量为1g时，图谱条带显色效果与取样量为2g时基本一致，表明供试品取样量1g，适用于本发明。

另外，本发明还对显色剂进行了筛选优化，结果发现1％三氯化铝溶液显色效果最佳，推测原因可能由于它是黄酮类化合物的专属显色剂，且在紫外365nm条件下也有吸收，故最终将其作为本发明优选的显色剂。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。