一种检测内毒素的方法与流程

本发明涉及一种检测内毒素的方法。

背景技术：

内毒素(lps)是一种高毒性的炎症刺激物，它可以与特异性细胞受体发生相互作用，从而产生炎性细胞因子，会导致发烧、败血症、多器官衰竭甚至死亡。由于可能产生严重的免疫反应，因此检测lps变得至关重要，尤其是注射液等生物制品等，以便于确保灭菌产品的安全。目前用于lps检测的主要方法是鲎试剂法(lal)，在许多领域中都被广泛使用。^[2]近年来还有一些基于lps抗体或适配体的电化学和光学传感器的研究，^[3,4]它们能够特异性地鉴别lps，并且克服一些传统方法的缺点。适配体是具有高特异性和与靶标结合的高亲和性的单链寡核苷酸(ssrna或ssdna)，它可以通过折叠成独特的三维结构从而与靶分子结合，范围从小分子到蛋白质甚至细胞。^[5]最近也已经有较多研究筛选出lps的适配体。

虽然鲎试剂法是目前测定lps的金标准，但是它对温度、ph的变化以及干扰因子都非常敏感，并且样品制备程序繁琐。更重要的是，该方法依赖于因过度捕捞而严重减少的动物鲎。而基于lps抗体、适配体的生物传感器虽然能够特异性识别lps，但是其实际应用仍然受到成本高，耗时长，且灵敏度低的限制。迄今为止，lps的检测灵敏度虽然已从毫摩尔水平提高到纳摩尔水平，但在飞摩尔水平检测lps仍然是一个挑战。对于石墨烯，如果仅通过石墨烯来制造传感器，则不能很好地控制反应条件。例如，石墨烯的生物相容性非常低，这会影响其生物识别过程。最重要的是，石墨烯传感器的选择性和灵敏度都会受到限制。因此，研究一种检测lps的新方法非常迫切。

技术实现要素：

这了解决上述存在问题，本发明通过研究，基于内毒素适配体构建了一种检测lps的生物传感器，具体开发了一种基于pdms芯片进行连续进样检测lps的方法。该检测系统将微流控芯片平台与适配体相结合，能够检测各种实际样品中的lps，且所需时间更短(1h)，实验设置更简单。

本发明的目的在于提供一种检测内毒素的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测内毒素的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品与荧光标记的lps适配体，进行第一次混合孵育；再加入还原氧化石墨烯和tbe缓冲液，进行第二次混合孵育；

2)将微流控芯片清洗干净后，用含ch3oh的tbe缓冲液充满整个微流控芯片的通道，然后将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的进样口中，在微流控芯片的进、出样口之间施加电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理后检测nafion膜通道与阳极之间的荧光强度；根据荧光强度和标准曲线判定待测样品中lps的含量；

上述微流控芯片中的nafion膜通道垂直于微流控芯片中的富集通道。

进一步的，所述待测样品包括血清样品、水溶液样品。

进一步的，步骤1)中，当待测样品为血清样品时，在待测样品与lps适配体混合之前，还需加入sds、β-巯基乙醇，并于92～100℃加热处理3～8min。

进一步的，所述sds、β-巯基乙醇在待测样品中的浓度分别为7～10mg/ml、3～10％v/v。

更进一步的，sds浓度为10mg/ml，β-巯基乙醇浓度为5％v/v。

进一步的，步骤1)中，所述荧光标记的lps适配体在加入待测样品之前，于92～100℃加热5～13min，并再于10～20℃冷却5～12min。更进一步的，lps适配体加热时间为5～10min，最佳的加热时间为10min；最佳的冷却时间为10min。

进一步的，步骤1)中，第一次混合孵育的温度为10～20℃，孵育时间为7～14min。

进一步的，步骤1)中，第二次混合孵育的时间不少于25min，温度为室温；第二次混合孵育时间在30min以上，检测效果会更佳。

进一步的，步骤1)中，第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为8～17μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为4～8nm。

进一步的，步骤2)中，所述tbe缓冲液的ph为7～7.8，tbe缓冲液中含有20～30％v/vch3oh。

进一步的，步骤2)中，当待测样品为血清样品时，所述tbe缓冲液ph为7～7.8，含有20～30％v/vch3oh和4～10％v/vch3cn。更进一步的，ch3cn的浓度为5％v/v时，检测效果会更佳。

进一步的，步骤2)中，电压处理时间为25～35min，电压为25～35v。

进一步的，步骤2)中，nafion膜通道的宽度为200～400μm，深度为20～200μm。

更进一步的，nafion膜通道的宽度为400μm，nafion膜通道的深度为45μm时，检测效果会更佳。

本发明的有益效果是：

(1)本发明建立了一种检测样品中内毒素的新方法，该方法的最低检测限(lod)为8fm，线性范围为：50fm-1nm(水溶液样品)，50fm-50pm(血浆样品)。本发明灵敏度高，选择性好，抗干扰能力较强。

(2)本发明方法检测所需时间短，消耗试剂量少，且不依赖于动物来源

(3)本发明能够检测注射液及脓毒症模型小鼠血清中的lps含量，能快速区分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌。

附图说明

图1.lps适配体的加热时间、冰浴时间以及与rgo孵育时间的对本发明检测lps的影响；(a)适配体加热时间对检测荧光条带的影响图；(b)适配体加热时间对检测荧光强度影响的曲线图；(c)lps适配体冰浴时间对检测荧光条带的影响图；(d)lps适配体冰浴时间对检测荧光强度影响的曲线图；(e)rgo的孵育时间对检测荧光条带的影响图；(f)rgo的孵育时间对检测荧光强度影响的曲线图。

图2.在teb缓冲液中使用有机溶剂ch3cn对本发明检测lps效果的影响。(a)ch3cn的浓度对检测荧光条带的影响图；(b)ch3cn浓度对检测荧光强度影响的曲线图。

图3.nafion膜尺寸对对本发明检测lps效果的影响。(a)nafion膜通道的宽度对检测荧光条带的影响图；(b)nafion膜通道的宽度对检测荧光强度影响的曲线图；(c)nafion膜通道的深度对检测荧光条带的影响图；(d)nafion膜通道的深度对检测荧光强度影响的曲线图。

图4.sds和β-巯基乙醇对检测lps效果的影响；(a)(b)为sds浓度对富集荧光条带的影响：(a)为样品，(b)为空白(无lps)；(c)(d)为β-巯基乙醇对富集荧光强度的影响：(c)样品，(d)为空白(无lps)。

图5.本发明方法检测对脓毒症模型小鼠血清中lps的检测。

图6.本发明方法的特异性检测；(a)和(b)分别为lps水溶液样品和lps血清样品对该方法的选择性。红色柱表示样品中同时存在竞争分子与lps，黑色柱表示样品中只存在竞争分子。(c)30v电压下三种菌液(10⁸cfu/ml)在ci-es平台的富集荧光强度。

图7.本发明方法检测lps的荧光强度(y)与相应的浓度(x)的关系的标准曲线。(a)为水溶液样品，(b)为血清样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种检测内毒素的方法

1)微流控芯片的制作：本实施例采用pdms(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片，其中含有nafion膜，nafion膜垂直于微流控芯片中的通道。微流控芯片的具体制作过程如下：

在真空干燥器中用三甲基氯硅烷处理硅片，以避免pdms粘附到硅片模具上。pdms与固化剂以重量比为10：1的比例充分混合均匀，放入真空干燥器中真空脱气至气泡完全消失后，缓慢浇注在硅片上，避免产生气泡。然后在95℃的加热板上固化2-3h，然后将pdms从硅片上剥离，这样硅片上的微结构就转移到了具有弹性的pdms上，并在进样口和出样口处打孔。之后在1mnaoh亲水处理过的载玻片上制作nafion膜：采用45μm厚，400μm宽的pdms微通道，通道两端各有一个孔，将1μlnafion膜液加到直通道的入口中，并在直通道出口处用注射器吸使nafion膜液充满整个直通道。放置3min后迅速剥离pdms通道，将含有nafion膜的载玻片在95℃下加热5min后使其固化，然后将含有通道的pdms芯片与含有nafion膜的载玻片一起放入等离子清洗机中进行表面改性处理，最后将pdms芯片不可逆地粘合到载玻片上，nafion膜垂直于pdms芯片的富集通道。

2)样品处理：首先将6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体在95℃沸水中加热10min，然后立即放入15℃水中冷却10min。而后将其与待测样品(如果待测样品为血清样品时，在待测样品与lps适配体混合之前，还需将待测样品中加入sds7～10mg/ml、β-巯基乙醇3～10％v/v，并于95℃加热处理5min)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo和1×tbe缓冲液，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为8～17μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为4～8nm。

上述rgo采用水热还原法制备：将50ml0.05mg/mlgo(氧化石墨烯)水溶液加入到聚四氟乙烯衬里的高压釜中，然后在180℃下加热6h。然后将高压釜冷却至室温。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用tbe缓冲液(ph为7～7.8，含有20～30％v/vch3oh；如果待测样品为血清样品时，1×tbe缓冲液含有20～30％v/vch3oh和4～10％v/vch3cn)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20～30v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测nafion膜与阳极之间的荧光强度；根据荧光强度和标准曲线判定待测样品中lps的含量。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

实施例2一种检测内毒素的方法(lps适配体的加热时间、冰浴时间以及与rgo孵育时间的优化)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

lps标准溶液的制备：用超纯水制备lps的标准储备液(1mg/ml)。通过适当稀释储备溶液以制备不同浓度的lps溶液。本实施例以10pm的lps溶液作为后续待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴分别加热1、5、10、12、20min，然后立即放入15℃水中分别冰浴1、5、10、12、20min。而后将其与待测样品(10pm的lps溶液，lps终浓度为1pm)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo和1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下分别旋转孵育10、30、60、180min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用tbe缓冲液(ph7.4，含有25％v/vch3oh)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜通道(nafion膜通道尺寸：深45μm，宽400μm)；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加30v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中nafion膜与阳极之间的荧光强度。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

本实施例分别探究了lps适配体的加热时间、冰浴时间以及与rgo孵育时间的最佳条件，检测结果如图1所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明lps适配体加热时间为5～10min、10～13min时，能够较好检测出样品中的lps，其中最佳的加热时间为10min；图(c)和(d)表明lps适配体冰浴时间为5～12min时，能够较好检测出样品中的lps，其中最佳的冰浴时间为10min；图(e)和(f)表明与rgo孵育时间为25min以上，能够较好检测出样品中的lps，其中孵育时间在30min以上，检测效果会更佳。

实施例3一种检测内毒素的方法(ch3cn的效果检测)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

lps加标血清的制备：采集健康人的血清，加入实施例2中已知浓度的lps标准储备液，将混合物在95℃沸水中加热5min，即得lps加标血清，将该加标血清加入sds10mg/ml，β-巯基乙醇5％v/v，并于95℃沸水中加热5min，作为后续的待检测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用不同的1×tbe缓冲液(ph7.4，含有25％v/vch3oh，ch3cn的浓度分别设置为0％、1％、3％、5％、7％、10％v/v)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中nafion膜与阳极之间的荧光强度。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

本实施例分别探究了ch3cn本发明检测lps效果的影响，检测结果如图2所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明血清样品基质比水溶液样品更复杂，我们发现在tbe缓冲液中添加ch3cn可改善带状稳定性，当没有ch3cn时，荧光条带较为松散。当ch3cn的浓度为4～10％v/vch3cn时，检测效果较好，当ch3cn的浓度为5％v/v时，检测效果会更佳。

实施例4一种检测内毒素的方法(nafion膜通道的深度和宽度的优化)

1)微流控芯片的制作：除了将nafion通道的尺寸宽度分别设置成100、200、400、600、800μm，深度设置成20、45、100、200μm；其他均同实施例1

2)样品处理：

lps标准溶液的制备：用超纯水制备lps的标准储备液(1mg/ml)。通过适当稀释储备溶液以制备不同浓度的lps溶液。本实施例以10pm的lps溶液作为后续待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品(10pm的lps溶液)混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用tbe缓冲液(含25％v/vch3oh)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加30v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中nafion膜与阳极之间的荧光强度。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

本实施例分别探究了nafion膜通道的宽度和深度对检测的荧光条带和荧光强度的影响，检测结果如图3所示，从中可以看出，图(a)和(b)表明nafion膜通道的宽度为200～400μm时，检测到的荧光条带较清晰、集中，检测到的荧光强度较高，其中最佳nafion膜通道的宽度为400μm；图(c)和(d)表明nafion膜通道的深度为20～200μm时，检测到的荧光条带较清晰、集中，检测到的荧光强度较高，其中最佳nafion膜通道的深度为45μm。

实施例5一种检测内毒素的方法(β-巯基乙醇和sds的效果检测)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

lps加标血清的制备：采集健康人体的血清，加入实施例2中已知浓度的lps标准储备液，即得lps加标血清，然后将上述加标血清中分别加入sds的浓度为7、10、13、18mg/ml；以及分别加入β-巯基乙醇的浓度为3、5、7、10、15％v/v，将各组混合物在95℃沸水中加热5min，分别作为后续的待检测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述各组待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用1×tbe缓冲液(ph7.4，含有25％v/vch3oh和5％v/vch3cn)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中nafion膜与阳极之间的荧光强度。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

本实施例探究了sds和β-巯基乙醇对检测lps效果的影响，检测结果如图4所示，从中可以看出图(a)和(b)表明sds浓度为7～10mg/ml时，检测到的荧光条带清晰、集中，最佳的sds浓度为10mg/ml，且空白组基本无荧光富集。图(c)和(d)表明β-巯基乙醇浓度为3～10％v/v时，检测到的荧光条带清晰、集中，最佳β-巯基乙醇浓度为5％v/v，且空白组基本无荧光富集；上述结果说明通过加入sds和β-巯基乙醇能够降低血浆样品荧光的干扰，且整个检测过程只需要5min。

实施例6一种检测内毒素的方法(动物实验)

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

lps血清样品的制备(动物实验)：取南方医科大学实验动物中心6-7周无特定病原体(spf)km小鼠。实验时它们的重量为31.6±1.0g。所有实验均按照国家实验室动物护理和使用指南进行。在动物实验中，腹腔注射15mg/kg的lps，然后分别在注射后4h和12h时取0.3ml血液用于lps试验。经测量，注射lps后小鼠肛温由36.2℃降至32.2℃。将获得的血液样品以300g离心10min，分离获得lps血清样品，之后将上述小鼠血清加入10mg/mlsds，5％v/vβ-巯基乙醇，并于95℃沸水中加热5min。作为后续的待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：实验之前，用1％bsa(牛血清白蛋白)在室温下修饰微通道10min，以防止非特异性粘附，然后将通道用超纯水洗涤三次并用tbe缓冲液(ph7.4，含有25％v/vch3oh和5％v/vch3cn)充满整个通道直至开始实验。将1-10μl枪头切去尖端后作为样品池插入进、出样口中。将上步第二次混合孵育的样品加样到微流控芯片的样品池中，微流控芯片中含有nafion膜(厚45μm，宽400μm)；同时将连接dc电源的铂电极插入样品池中，在微流控芯片的进、出样口之间施加20v电压进行处理，进样口处为阳极，电压处理30min后检测各组中nafion膜与阳极之间的荧光强度。

上述荧光强度的具体测量过程为：通过imagej软件分析荧光图像，使用imagej的subtract函数从图像中扣除背景空白值。然后测量nafion膜与阳极之间的浓度荧光条带(image→adjust→threshold)以得到荧光强度。

检测结果如图5所示，可见利用本发明方法分别对注射lps4h及12h后的脓毒症模型小鼠血清进行测定，均能检测出小鼠血清中的lps，且对照组基本无荧光富集。

实施例7一种检测内毒素的方法(细菌实验及特异性检测)

方法：

1)微流控芯片的制作：同实施例1

2)样品处理：

①基体为水溶液：

空白组：已知浓度的lps标准水溶液，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

焦磷酸盐组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度焦磷酸盐，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

fad⁺组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度fad⁺，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

nad⁺组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度nad⁺，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

amp组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度amp，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

adp组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度adp，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

atp组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度atp，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

磷脂酰胆碱组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度磷脂酰胆碱，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

脂磷壁酸组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度脂磷壁酸，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

β-d-葡聚糖组：已知浓度的lps标准水溶液+同浓度β-d-葡聚糖，作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中冰浴10min。而后将其与上述待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

②基体为血清：除了需要在lps加标血清中加入10mg/mlsds和5％v/vβ-巯基乙醇在沸水中进行加热处理5min与①不同，其他均与①相同。

③大肠杆组：通过4,000rpm离心10min收集大肠杆菌，并用1×tbe(ph7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×tbe溶液中(c＝10⁸cfu/ml)作为待测样品。

④金黄色葡萄球菌组：通过4,000rpm离心10min收集金黄色葡萄球菌，并用1×tbe(ph7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×tbe溶液中(c＝10⁸cfu/ml)作为待测样品。

⑤白色念珠菌组：通过4,000rpm离心10min收集白色念球菌，并用1×tbe(ph7.4)洗涤3遍，然后以13,000rpm离心10min破碎细菌，取上清后稀释于1×tbe溶液中(c＝10⁸cfu/ml)作为待测样品。

取6-fam(6-羧基荧光素)标记的lps适配体(由生物公司设计合成)在95℃水浴加热10min，然后立即放入15℃水中分别冰浴10min。而后将其与上述各待测样品混合并继续在15℃进行第一次孵育10min。然后再加入还原氧化石墨烯rgo以及1×tbe缓冲液(ph7.4，)，进行第二次混合孵育，即在室温下旋转孵育30min后上样进行检测。

在上述第二次混合孵育体系中，还原氧化石墨烯的浓度为10μg/ml、荧光标记的lps适配体浓度为6nm。

3)微流控芯片检测：同实施例2。

检测结果如图6所示，从中可以看出，本发明方法具有较好的特异性。在一些竞争生物分子(焦磷酸盐，fad⁺，nad⁺，amp，adp，atp，磷脂酰胆碱，lta，β-d-葡聚糖)的存在下，根据其荧光强度来评估其选择性，如图6(a)和(b)所示，所有竞争性生物分子均不会引起荧光强度的显著增加。我们所用的是已报道的能够特异性识别lps的适配体，因此，只有lps能诱导荧光强度发生显著的变化。该方法还能够区分革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。我们使用大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)，金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和白色念珠菌(真菌)作为实例进行实验。并且在上述优化实验获得的最佳条件下，对新鲜细菌悬浮液(c＝10⁸cfu/ml)进行测定。(a)和(b)分别为lps水溶液样品和lps血清样品对该方法的选择性。红色柱表示样品中同时存在竞争分子与lps，黑色柱表示样品中只存在竞争分子。(c)30v电压下三种菌液(10⁸cfu/ml)在的富集荧光强度。

本发明能够检测注射液及脓毒症模型小鼠血清中的lps含量，能快速区分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌。

实施例8标准曲线的制备

方法：通过该方法分别测定水溶液和血清中八种不同浓度(50,100,500,10³,10⁴,5×10⁴,10⁵,10⁶fm和50,100,500,10³,5×10³,10⁴,2×10⁴,5×10⁴fm)的lps标准溶液获得线性图。通过测定lps在8种不同浓度的标准溶液获得。每个点对应于三次独立实验的平均值。三次重复实验的rsd<4.0％。

结果：

标准曲线的制备结果如图7所示，从中可以看出，本发明方法的最低检测限(lod)为8fm，线性范围为：50fm-1nm(水溶液样品)，见图7(a)；50fm-50pm(血清样品)，见图7(b)；最低检测限(lod)为8fm。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。