基于中红外光谱快速鉴定和检测原肌球蛋白的方法与流程

本发明属于生物鉴定领域，涉及水产品中主要过敏原原肌球蛋白的鉴定和检测方法，具体涉及基于中红外光谱技术的过敏原原肌球蛋白快速鉴定方法，用于快速鉴定和检测甲壳类和贝类中的过敏原原肌球蛋白。

背景技术

水产品中，虾蟹(甲壳)类和贝类为水产品的主要致敏食物，而原肌球蛋白(tropomyosin,tm)是其中最主要的过敏原，其引起的过敏症状日趋复杂和严重；而传统的烹饪手段并不能降解原肌球蛋白，所以此类水产品经常引起食物过敏事件，因此十分有必要探索出快速鉴别和检测过敏原原肌球蛋白的方法。

目前的过敏原原肌球蛋白检测技术主要包括三类。第一类是分子生物学方法，以检测编码过敏原dna片段的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)技术为代表；第二类是免疫学方法，以检测过敏原性的酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)为代表；第三类是仪器分析法，以分析全蛋白或酶解后肤段氨基酸序列的质谱技术和基于表面等离子体共振的生物传感器为代表。

申请号cn201711037844.3的专利文件公开了一种基于抗体技术的近场光波靶向传感器检测甲壳类过敏原的方法，利用近场光波靶向传感器采集和检测荧光强度变化进行检测；申请号cn201510711292.4的专利文件公开了一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，先后采用了质谱技术与竞争性elisa检测法；申请号201410231103.9的专利文件公开了一种检测水产类过敏原的胶体金试纸条，由载体板、硝酸纤维膜等组成；申请号201010521189.0的专利文件公开了一种快速检测原肌球蛋白的磁性免疫层析方法及检测试纸条的制备，用磁信号仪定量检测原肌球蛋白能达到0.15μg/ml。

上述的检测方法中，质谱技术的仪器成本高、操作要求高，并且用sds电泳分离蛋白导致蛋白变性或者需要经酶切分别对肽段进行检测分析，对被检食品样品有损害；pcr检测技术用来检测加工食品可能出现假阴性结果；免疫学检测技术基于抗原抗体结合反应，然而抗体制备困难，耗时长；胶体金试纸条样品检测耗时长，且所需抗体制备困难；磁性免疫层析方法及检测试纸条的前处理方法繁杂，耗时长且同样需要抗体；生物传感器的检测方法步骤繁琐且同样需要抗体。

因此，需要对现有方法加以改进，获得一种准确性和特异性高、不破坏原有样品，且所述样品量较少的检测鉴定方法，实现快速、准确地对水产品中过敏原原肌球蛋白的检测。

中红外光谱技术是指分子能选择性吸收某些波长的红外线，而引起分子中振动能级和转动能级的跃迁。检测红外线被吸收的情况可得到物质的红外吸收光谱，通过比对标准样品的红外谱图的特征峰以及待测样品的红外谱图，可完成样品的快速鉴定与检测。

现有研究中，采用红外检测分析研究蛋白质的二级结构，但目前还没有采用红外光谱对蛋白质进行检测或鉴定的报道。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种基于中红外光谱快速鉴定与检测原肌球蛋白的方法。

本发明技术方案为，一种基于中红外光谱快速鉴定和检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从待测样品中获取原肌球蛋白，进行红外光谱测定，得到一级中红外谱图数据；

(2)所获得的一级中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中寻找是否存在原肌球蛋白的特征峰，从而判断样品中是否含有原肌球蛋白，并进一步判断样品中是否有来源于贝类或者虾类的原肌球蛋白。

所述待测样品源自虾类水产品、虾类水产品制品或者含有虾类水产品时，所述的特征峰包括1662±1cm^-1、1562cm^-1,1551±1cm^-1、1363±1cm^-1、1314±2cm^-1和1240±1cm^-1；待测样品源自蟹类水产品、蟹类水产品制品或者含有蟹类水产品时，特征峰包括1699cm^-1,1688±1cm^-1,1683cm^-1,1674cm^-1,1667±1cm^-1,1657cm^-1,1651cm^-1,1647cm^-1,1637cm^-1,1630cm^-1,1618±1cm^-1,1611cm^-1,1563cm^-1,1557cm^-1,1553cm^-1,1367cm^-1,1347cm^-1,1302cm^-1,1247cm^-1,1147cm^-1和1099cm^-1；待测样品源自贝类水产品、贝类水产品制品或者含有贝类水产品时，特征峰包括1580cm^-1、1570±1cm^-1、1548±1cm^-1、1363±1cm^-1和1297±2cm^-1。所述的虾类水产品为南美白对虾、草虾、基围虾、明虾和皮皮虾中的至少一种；所述的蟹类水产品为石蟹和梭子蟹中的至少一种；所述的贝类水产品为蛤蜊、蛏子、螺蛳、扇贝和贻贝中的至少一种。

步骤(1)中，红外光谱测定扫描所获得的原始图谱经过基线校正、光谱平滑、光谱计算和归一化处理的预处理操作，得到一级中红外图谱，经二阶求导后，得到二阶导数图谱。

红外光谱测定的扫描范围选自4000～400cm^-1区间内，光谱分辨率为2～6cm^-1；扫描次数为15～20次，取平均光谱。

本发明的优选实施方式为：使用atr单点法，测试温度为20-25℃，湿度为45％以内，光谱分辨率为4cm^-1，测量范围在4000～400cm^-1，图谱分析选取1800-1000cm^-1的范围，扫描次数为16次。

步骤(2)中，在二阶导数图谱中寻找是否存在用于鉴定蛋白质的一组红外特征峰，以确定样品为蛋白质。

所述用于鉴定蛋白质的一组红外特征峰包括：1693±1cm^-1、1688cm^-1、1678cm^-1、1646cm^-1、1513cm^-1。

所述过敏原原肌球蛋白的特征峰通过以下方法获得：

(a)收集不同来源虾类、蟹类、贝类的原肌球蛋白样品和非原肌球蛋白样品，测定中红外谱图；

(b)所获得的中红外谱图经过二阶求导，在二阶导数的红外图谱中找出原肌球蛋白与非原肌球蛋白的差异峰；

(c)分析不同来源原肌球蛋白二阶导数的红外图谱，分析虾类、蟹类、贝类水产品中原肌球蛋白共有的特征峰。

例如，同属虾类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1662±1cm^-1、1562cm^-1,1551±1cm^-1、1363±1cm^-1、1314±2cm^-1和1240±1cm^-1；同属蟹类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1699cm^-1,1688±1cm^-1,1683cm^-1,1674cm^-1,1667±1cm^-1,1657cm^-1,1651cm^-1,1647cm^-1,1637cm^-1,1630cm^-1,1618±1cm^-1,1611cm^-1,1563cm^-1,1557cm^-1,1553cm^-1,1367cm^-1,1347cm^-1,1302cm^-1,1247cm^-1,1147cm^-1和1099cm^-1；同属贝类的水产品原肌球蛋白中，具有一组共同的特征峰：1580cm^-1、1570±1cm^-1、1548±1cm^-1、1363±1cm^-1和1297±2cm^-1。

提取原肌球蛋白的方法包括以下步骤：

a.待测样品用丙酮抽提后，按1g：4～10ml比例加入ph＝9.0～9.4的tris-hcl缓冲液，匀浆后低温离心得到原肌球蛋白粗提液；

b.原肌球蛋白粗提液经过沉淀法富集其中的原肌球蛋白，并且经过纯化，冷冻干燥，得到原肌球蛋白冻干粉。

上述方法还可以用来测定原肌球蛋白的含量，通过测定原肌球蛋白红外光谱特征峰的峰高与峰面积，并与标准曲线比对，计算样品中原肌球蛋白的含量。

本发明克服现有技术缺陷，提供一种基于中红外光谱技术的水产品中主要过敏原原肌球蛋白快速鉴定与检测方法，通过比对原肌球蛋白的红外谱图特征峰和被测样品的红外谱图，无需抗体即可实现快速检测，能达到快速定性鉴别和定量检测目的，同时实现无损食品要求。

本发明的有益效果在于：

(1)用提取原肌球蛋白的方法从待测样品中提取和富集、纯化原肌球蛋白进行检测和鉴定，前处理方法简单、时间短，而且对红外光谱检测没有干扰；

(2)采用中红外光谱的分析方法，在数秒内就可以完成样品检测，特征性强，提供结构信息丰富，普适性强；通过进行图谱比对和特征峰的分析，可完成对被测样品的快速鉴定、鉴别与定性或定量检测，而且检测、鉴定结果准确性高；既可以用于鉴定水产品及其加工产品中是否含有过敏原原肌球蛋白并检测其含量，也可以用于判断加工食品中过敏原的来源；

(3)可对微量样品进行测试，能反映被测样品的组成和结构特性，形成被测样品特有的红外光谱图特征峰，检测过程中，所获得的蛋白样品不被破坏，因此提取后的原肌球蛋白还可以再重新进行检测或利用；

(4)无需特异性的抗体或者特殊试剂、试纸、仪器，与现有的方法相比，大幅度降低了成本及操作难度。

附图说明

图1为实施例1不同蛋白的红外吸收图谱(1800-1000cm^-1)

图2为实施例1不同蛋白的红外二阶导数图谱(1800-1000cm^-1)

图3为实施例2不同虾类和贝类水产品中原肌球蛋白的红外吸收图谱(1800-1000cm^-1)

图4为实施例2不同虾类和贝类水产品中原肌球蛋白的红外二阶导数图谱(1800-1000cm^-1)

图5为实施例2不同蟹类水产品中原肌球蛋白的红外吸收图谱(1800-1000cm^-1)

图6为实施例2不同蟹类水产品中原肌球蛋白的红外二阶导数图谱(1800-1000cm^-1)

具体实施方式

实施例1

以南美白对虾为水产品样品进行处理，提取原肌球蛋白。

对水产品前处理方法具体为将虾去壳去头去虾线处理，用丙酮抽提虾肉至无色，之后按1:5(w/v)的比例加入20mmtris-hcl缓冲液(含0.5mol/lnacl，ph9.2)，匀浆30s得肌肉匀浆液；10000r/min低温离心20min，得原肌球蛋白粗提取液。

再用常规实验方法硫铵沉淀法、等电点沉淀法对所述原肌球蛋白粗提取液中的原肌球蛋白进行富集，通过常规脱盐手段即透析对过敏原进行纯化，然后对纯化后的原肌球蛋白冷冻干燥，得原肌球蛋白(tm)冻干粉。

使用spectrumgx傅里叶变换红外光谱仪(perkinelmer公司),以及固体测量atr单点配件对原肌球蛋白冻干粉和其他六种蛋白冻干粉：牛血清蛋白(bsa)、小清蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶和猪胃黏蛋白酶，进行光谱数据采集。所使用的蛋白冻干粉的量约为1mg。

光谱采集方式和采集条件为：使用atr单点法，测试温度为20-25℃，湿度为45％以内，光谱分辨率为4cm^-1，测量范围为4000-400cm^-1，扫描次数为16次。

采用perkin-elmer公司spectrumv3.02操作软件对采集到的图谱进行基线校正，光谱平滑，光谱计算和归一化处理的预处理操作，得到原肌球蛋白及其他六种蛋白的一级红外图谱。不同种类蛋白的红外检测结果(1800-1000cm^-1)如图1所示。

已知蛋白质的红外吸收图谱应具有明显的酰胺ⅰ带(1700～1600cm^-1)和酰胺ⅱ带(1600～1500cm^-1)。由图1可知，不同蛋白分别有其特有的酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带组合峰。

而红外吸收图谱上的吸收峰重叠很严重，以致很多特征峰被掩盖。因此再对此红外吸收图谱进行二阶求导，得到原肌球蛋白和其他六种蛋白特有的二阶导数图谱，对原图谱上的重叠峰进行分辨，尤其是酰胺ⅲ带(1400～1200cm^-1)。二阶导数图谱见图2。

由图2可见，经过二阶求导，可以得到原肌球蛋白和其他六种蛋白特有的二阶导数图谱，对原图谱上的重叠峰进行分辨。

选取三条酰胺带所在范围的峰值，比对发现1693±1cm^-1、1688cm^-1、1678cm^-1、1646cm^-1、1513cm^-1峰为7种不同蛋白质的共有峰，可判定这5个峰为鉴定蛋白质的特征峰；而原肌球蛋白不同于其他六种蛋白质的差异峰有11种。

实施例2

分别取南美白对虾、草虾、基围虾、明虾、皮皮虾、石蟹、梭子蟹、蛤蜊和蛏子，用实施例1所述的方法提取其原肌球蛋白冻干粉，并用实施例1的方法进行中红外光谱数据采集。

不同虾类和贝类以及蟹类水产品中原肌球蛋白的红外吸收图谱(1800-1000cm^-1)如图3和图5所示。

由图3和图4可看出，各水产品中原肌球蛋白图谱的酰胺ⅰ带都在1638-1647cm^-1范围内；酰胺ⅱ带都在1536-1543cm^-1范围内。

由图5和图6可以看出，石蟹和梭子蟹原肌球蛋白图谱的酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带也在此范围内。

对所获得的红外图谱进一步进行二阶求导，结果如图4和图6所示。

从图4中选取三条酰胺带所在范围的峰值，对比分析发现除了上述确定的7个蛋白质共有峰(1693±1cm^-1、1688cm^-1、1678cm^-1、1646cm^-1、1513cm^-1)之外，虾类水产品中原肌球蛋白都含有1662±1cm^-1、1562cm^-1、1551±1cm^-1、1363±1cm^-1、1314±2cm^-1、1240±1cm^-1这一组特征峰；贝类水产品中原肌球蛋白都含有1580,1570±1，1548±1，1363±1,1297±2cm^-1这一组特征峰。

从图6中选取石蟹和梭子蟹原肌球蛋白三条酰胺带所在范围的峰值，对比分析发现，除了与上述虾类和贝类7个蛋白质共有峰之外，蟹类水产品中原肌球蛋白都含有包括1699cm^-1,1688±1cm^-1,1683cm^-1,1674cm^-1,1667±1cm^-1,1657cm^-1,1651cm^-1,1647cm^-1,1637cm^-1,1630cm^-1,1618±1cm^-1,1611cm^-1,1563cm^-1,1557cm^-1,1553cm^-1,1367cm^-1,1347cm^-1,1302cm^-1,1247cm^-1,1147cm^-1和1099cm^-1这一组特征峰。

由此可见，通过中红外光谱，可以快速鉴定水产品及其制品中的原肌球蛋白。

并且根据样品中特征峰的位置，可以判断食品中过敏原原肌球蛋白来源于虾类、蟹类还是贝类。