基于单细胞水平的早期癌症检测方法与流程

本发明涉及一种基于单细胞水平的早期癌症检测方法，属于生物细胞检测领域。

背景技术：

癌变过程中肿瘤细胞具有独特的代谢表型，因此，肿瘤代谢研究对肿瘤学大量的应用很有前景，包括早期癌症诊断，疾病预后，治疗效果评估和治疗进展。单细胞水平的代谢研究是非常有用的，因为它给揭示细胞异质性和解读复杂代谢的相互作用提供了机会，从而进一步解密各种代谢途径。因此，生物传感平台能够从单细胞水平区分正常细胞与癌细胞的代谢，这对于理解癌变的分子机理和早期癌症的诊断以及预后尤其重要。

《分析化学》2010年82卷5082-5087页论文(anal.chem.2010,82,5082–5087)“肿瘤代谢分析中单细胞乳酸释放的光学检测”中提出的一种基于单细胞水平的早期癌症检测方法，但该方法的灵敏度不够高，重复性较差，因此本发明进一步优化出灵敏度更高，重复性更好的试验参数。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种更有效、更加优化的基于单细胞水平的早期癌症检测方法，该方法将乳酸脱氢酶修饰在纳米探头尖端，可以催化乳酸转化并产生nadh作为荧光检测物来监测肿瘤细胞的细胞外乳酸浓度。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:

一种基于单细胞水平的早期癌症检测方法，包括如下步骤：

步骤1，纳米探头尖端二氧化硅表面在aptes乙醇溶液中进行硅烷化，干燥后在戊二醛溶液中进行活化，然后在乳酸脱氢酶溶液中培养进行固定化。

步骤2，选择人乳腺癌细胞株mcf7作为试验用细胞株，并对试验用细胞株进行消化吹打处理形成细胞悬液。

步骤3，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×10⁴个细胞/cm²接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着。

步骤4，细胞组依次附着24h、25h、26h、27h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，向细胞浴槽中分别加入100μl、110ul、120ul、130ul的细胞培养液，细胞培养液中添加nad+溶液。

步骤5，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，在倒置荧光生物显微镜下调整纳米探头靠近细胞膜，检测并记录反应过程中释放的nadh荧光光子数。

其中，步骤1中，所述aptes乙醇溶液浓度为5％。

其中，步骤1中，所述戊二醛溶液浓度为5％。

其中，步骤1中，所述乳酸脱氢酶溶液浓度分别为2mg/ml，1.8mg/ml,1.6mg/ml,1.5mg/ml。

其中，步骤2中，先将试验用细胞株用pbs缓冲液清洗，清洗后用0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，细胞消化后用含血清的培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀即可。

其中，步骤3中，所述细胞浴槽的盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片。

其中，步骤4中，所述添加nad+溶液的终浓度为2mm、1.8mm、1.6mm、1.5mm。

其中，步骤5中，所述纳米探头通过微操作系统进行控制移动。

其中，步骤5中，所述nadh的激发波长为360nm，发射波长为460nm。

本发明的有益效果如下。

本发明检测方法细胞外乳酸浓度的检测结果精确，能够真实反映在某个浓度下对应的单个细胞荧光信号值，从而能够真实准确反映乳酸的胞外释放。本发明检测方法能够从单细胞水平区分正常细胞与癌细胞的代谢，这对于理解癌变的分子机理和早期癌症的诊断以及预后具有重要的意义，具体结果见表1。

附图说明

图1为在4mm乳酸下辅助因子nad+浓度对标准化荧光强度的影响示意图；

图2为使用光纤纳米传感器上的乳酸脱氢酶进行乳酸检测的校准曲线图；

图3为测量的释放乳酸的扩散曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。

一种基于单细胞水平的早期癌症检测方法，包括如下步骤：

步骤1，纳米探头尖端二氧化硅表面在5％aptes乙醇溶液中60℃保持3小时进行硅烷化，120℃真空干燥2小时后在5％戊二醛溶液中4℃保持12小时进行活化，然后分别在2mg/ml，1.8mg/ml,1.6mg/ml,1.5mg/ml乳酸脱氢酶溶液中4℃培养24小时进行固定化。

步骤2，选择人乳腺癌细胞株mcf7作为试验用细胞株，在显微镜下观察其生长状态，去除原有培养基，用pbs缓冲液清洗细胞1-2次，向培养瓶中加入2ml0.25％的胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞消化结束，加入2ml含血清的新鲜培养基终止消化，将混悬液吸到离心管中，1000r/min离心5min，得到的沉淀物用含血清的培养基重悬吹匀。

步骤3，用血球计数板测定细胞悬液中的细胞密度，以细胞密度为1×10⁴个细胞/cm²接种到细胞浴槽的盖玻片上用于细胞附着，此盖玻片为细胞可爬壁生长的盖玻片。

步骤4，细胞分别附着24h、25h、26h、27h后，用pbs缓冲液冲洗粘附在盖玻片上的细胞3次，向细胞浴槽中分别加入100μl、110ul、120ul、130ul的细胞培养液，细胞培养液中添加终浓度为2mm的nad+溶液。

步骤5，将细胞浴槽放入纳米光电生化检测仪，在倒置荧光生物显微镜下通过微操作系统调整纳米探头靠近细胞膜，检测并记录反应过程中释放的nadh荧光光子数。

nadh的激发波长为360nm，发射波长为460nm。

固定在纳米探头上的乳酸脱氢酶通过催化溶液中的乳酸及nad+生成丙酮酸和带有荧光敏感的nadh。由于辅助因子nad+涉及ldh酶促反应，本发明首先研究了其浓度对乳酸纳米传感器响应的影响。在不同的nad+的浓度下监测4mm的乳酸存在时乳酸纳米传感器响应。如图1，荧光信号随着nad+浓度的增加而增加，直到1.5-2mm时获得平稳值。

通过nadh的荧光光子数可以反映出相应的乳酸浓度。如图2所示，在箭头表示处加入1mm乳酸后测定纳米传感器的实时反应，乳酸浓度与荧光光子的校正曲线可以看出，在一定浓度内，乳酸浓度与nadh的荧光光子数呈线性相关，并且修饰的纳米探头的响应时间很快，1s。

如图3所示，在癌症细胞膜外的不同位置检测胞外乳酸浓度，可以发现胞外乳酸浓度成扩散曲线方式向外扩散。横坐坐标为纳米探针离细胞的距离，纵坐标为检测到的乳酸浓度，说明了纳米探针围绕附着在培养皿片上的单个细胞进行检测的途径。

本发明通过优化细胞附着时间、细胞培养液容积、ldh浓度、纳米探针激活时间等参数，进行了三组试验，从而得出更好的nad⁺浓度，更灵敏更准确的胞外乳酸释放分布情况，在最佳参数组合下(表1中第四行数据)，nad⁺浓度比论文报道结果减低25％，意味着灵敏度也提高了25％；在胞外离细胞乳酸释放检测结果中，离细胞最近(0um)及最远(200um)的乳酸浓度分别提高21％和50％。

表1：第1行为背景技术中论文的试验参数，第二至第四行参数为本发明的试验参数。乳酸脱氢酶英文简写:ldh，β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物英文简写：nad⁺，nad+浓度是指：荧光信号稳定时nad⁺的浓度(mm)。