一种测定磁微粒表面微量氨基含量的试剂及其快速测定方法与流程

本发明涉及生物医药ivd领域，尤其是涉及一种测定磁微粒表面微量氨基含量的试剂，本发明还涉及采用该试剂快速测定磁微粒表面微量氨基含量的方法。

背景技术：

磁微粒是近年来ivd（体外诊断）行业使用比较广泛的原料之一，表面氨基修饰是磁性纳米微球生物应用最基本与常用的官能团，已有大量的偶联化学方法是基于表面氨基基团基础发展起来的。然而表面氨基的定量是否准确是关系到偶联策略与方案的关键因素，因此其表面修饰基团的定量分析显得尤为重要，特别是对于微量样品的微量氨基检测更有实际意义。

目前氨基测定技术主要有滴定法、茚三酮法、荧光法。滴定法对于固相载体表面氨基密度比较高的材料测定时效果较好，但是当表面氨基密度很低时，此种方法的可行性就会受到一定限制。除此以外，检测方法的专一性也是一个很重要的问题，如果用此种方法进行滴定，酸不仅会与伯胺发生反应，而且会与仲胺，叔胺也发生反应，这就不能满足只是检测伯胺的特异性的需要。另外，如果固相载体表面接有其他酸性或者碱性的功能基团，同样会严重影响滴定结果。茚三酮法对于固相载体表面的显色机理尚且不是十分清楚，而且易受实验条件的干扰。荧光法对于磁微粒表面氨基含量测定会有荧光猝灭现象，影响其测定的准确性。

由于上述方法所存在的不足，使得目前对磁微粒表面微量氨基含量的测定难度大，测定时间长，操作复杂、误差大，稳定性不足，直接影响了检测磁微粒表面微量氨基含量方法的直接应用，因此亟待提供一种快速、可靠、准确地检测磁微粒表面微量的氨基含量的方法和检测试剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够快速、准确地测定磁微粒表面微量氨基含量的试剂；本发明同时还提供一种快速测定磁微粒表面微量氨基含量的方法，该方法灵敏度高、精度好、稳定性好，且能同时测定大批量样品。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的测定磁微粒表面微量氨基含量的试剂，包括由试剂a和试剂b按45～55:1之比例配制的bca试剂；其中

所述试剂a包括以下组分：0.8～1.2%bca-na2，1.8～2.2%na2co3•h2o，0.1～0.2%酒石酸钠，0.4～0.8%naoh和0.95～1.2%nahco3，其ph值为11～11.5；

所述试剂b为3.5～4.5%的cuso4•h2o溶液。

实际配制时，所述bca试剂可以按试剂a:试剂b=50:1之比例配制而成，其中试剂a中含有1%bca-na2，2%na2co3•h2o，0.16%酒石酸钠，0.4%naoh和0.95%nahco3，采用naoh调其ph值为11.25；试剂b为4%的cuso4•h2o溶液。

所述bca试剂也可以按试剂a:试剂b=45:1之比例配制而成，其中试剂a中含有0.8%bca-na2，1.8%na2co3•h2o，0.1%酒石酸钠，0.4%naoh和0.95%nahco3，采用naoh调其ph值为11；试剂b为3.5%的cuso4•h2o溶液。

所述bca试剂还可以按试剂a:试剂b=55:1之比例配制而成，其中试剂a中含有1.2%bca-na2，2.2%na2co3•h2o，0.2%酒石酸钠，0.8%naoh和1.2%nahco3，采用nahco3调其ph值为11.5；试剂b为4.5%的cuso4•h2o溶液。

采用本发明试剂快速测定磁微粒表面微量氨基含量的方法包括下述步骤：

第一步，取待测磁微粒，采用去离子水和无水乙醇洗涤，磁铁分离后弃上清，加入0.8～1.2mmol/l的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂于37～60℃条件下反应一定时间，反应结束后，磁铁分离，取上清液于反应试剂瓶中，加入现场配制的bca试剂37℃反应8～15min，得到样品溶液；取未加入磁微粒的0.8～1.2mmol/l的2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂在同样条件下处理后作为对照，取上清液于反应试剂瓶中，加入现场配制的bca试剂37℃反应8～15min，得到标准溶液；

第二步，取0.8～1.2mmol/l的2-亚氨基硫烷盐酸盐空白试剂，依次稀释至浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/l后，加入现场配制的bca试剂37℃反应8～15min，得到空白溶液；

第三步，测定第一步和第二步中的样品溶液、空白溶液和标准溶液在562nm下的吸光值，根据标准溶液吸光值拟合线性方程：y=ax+b，其中a为拟合曲线斜率，b为直线截距；根据样品溶液和空白溶液吸光值计算其2-亚氨基硫烷盐酸盐浓度，进而计算出第一步中待测磁微粒表面氨基含量。

其中第三步中计算磁微粒表面氨基含量的公式为：-nh2(umol/g)=[(a空白-b)/a-(a样品-b)/a]×500/m样品，其中a空白为所述空白溶液的a值；a样品为所述样品溶液的a值。

本发明的优点在于配制的试剂能够快速、准确地测定磁微粒表面微量的氨基含量。本发明测定方法为间接检测方法，具有灵敏度高、精密度好、稳定性好的优点。具体来说，使用本发明方法对磁微粒表面微量氨基含量进行测定，灵敏度高达1umol/g；对磁微粒表面微量氨基含量的相对标准偏差小于5%；不同时间测定同一批样品的cv值小于5%；此外本发明方法能够快速高效地同时测定大批量样品，具有很好的实用性。

附图说明

图1是本发明的反应机理图。

图2为本发明实施例2中采用3#bca试剂得到的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的反应机理如图1所示，磁微粒表面微量的氨基和itl（2-亚氨基硫烷盐酸盐）反应生成含有巯基基团的磁微粒；itl具有强的还原性，能够还原cu²⁺成cu⁺，cu⁺能够与bca试剂络合成一种紫色物质，在562nm下具有强的吸收峰。

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，其中所用的试剂和实验仪器如无特殊说明，均为市售产品，其中采用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1配制测定磁微粒表面微量氨基含量的试剂

本发明所述的bca试剂由试剂a和试剂b组成，使用时现场进行调配使用。

实际配制时，可以按照以下三种组分进行配制：

1、1#bca试剂可以按试剂a:试剂b=45:1之比例配制而成：其中试剂a中含有0.8%bca-na2，1.8%na2co3•h2o，0.1%酒石酸钠，0.4%naoh和0.95%nahco3，采用naoh调其ph值为11；试剂b为3.5%的cuso4•h2o溶液。。

2、2#bca试剂可以按试剂a:试剂b=55:1之比例配制而成：其中试剂a中含有1.2%bca-na2，2.2%na2co3•h2o，0.2%酒石酸钠，0.8%naoh和1.2%nahco3，采用nahco3调其ph值为11.5；试剂b为4.5%的cuso4•h2o溶液

3、3#bca试剂可以按试剂a:试剂b=50:1之比例配制而成：其中试剂a中含有1%bca-na2，2%na2co3•h2o，0.16%酒石酸钠，0.4%naoh和0.95%nahco3，采用naoh调其ph值为11.25；试剂b为4%的cuso4•h2o溶液。

实施例2采用上述配制的1#、2#、3#试剂对磁微粒表面微量氨基含量进行测定

1、采用1#试剂快速测定磁微粒表面微量氨基含量：

取待测磁微粒40ug，用去离子水和无水乙醇各洗涤三次，磁铁分离5min，弃上清，加入0.8mmol/l2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂（itl试剂）500ul于37℃反应2h；同时取空白试剂（未加入磁微粒）0.8mmol/litl试剂500ul于37℃反应2h；分别取上清液450ul于反应试剂瓶中；

分别将1#bca试剂600ul加入上述反应后取出的itl试剂中，于37℃反应8min；

标准曲线建立：将itl试剂分别稀释成浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/l的溶液（450ul），加入bca试剂600ul于37℃反应8min；测定样品溶液、空白溶液和标准溶液在562nm下的吸光值，根据标准溶液吸光值拟合线性方程；根据样品溶液和空白溶液吸光值计算其itl浓度，进而按公式-nh2(umol/g)=[(a空白-b)/a-(a样品-b)/a]×500/m样品（其中a空白为述空白溶液的a值；a样品为所述样品溶液的a值），计算磁微粒表面氨基基团含量。

2、采用2#试剂快速测定磁微粒表面微量氨基含量：

取磁微粒80ug，去离子水、无水乙醇各洗涤三次，磁铁分离15min，弃上清，加入1.2mmol/litl试剂500ul于60℃反应4h；同时空白试剂（未加入磁微粒）1.2mmol/litl试剂500ul于60℃反应4h。反应结束后，磁铁分离15min，取上清液450ul于反应试剂瓶中；空白试剂取450ul于反应试剂瓶中。将2#bca试剂800ul加入反应后取出的itl试剂于37℃反应15min；

标准曲线建立：将itl试剂稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/l的450ul，加入2#bca试剂800ul于37℃反应15min。测定样品溶液、空白溶液和标准溶液在562nm下的吸光值，根据标准溶液吸光值拟合线性方程，根据样品溶液和空白溶液吸光值计算其itl浓度，计算磁微粒表面氨基基团含量（计算方法同上）。

3、采用3#试剂快速测定磁微粒表面微量氨基含量

取磁微粒50ug，去离子水、无水乙醇各洗涤三次，磁铁分离10min，弃上清，加入1mmol/litl试剂500ul于60℃反应3h；同时空白试剂（未加入磁微粒）1mmol/litl试剂500ul于60℃反应3h。反应结束后，磁铁分离10min，取上清液450ul于反应试剂瓶中；空白试剂取450ul于反应试剂瓶中。将3#bca试剂700ul加入反应后取出的itl试剂于37℃反应10min；

标准曲线建立：将itl试剂稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/l的450ul，加入3#bca试剂700ul于37℃反应10min。测定样品溶液、空白溶液和标准溶液在562nm下的吸光值，根据标准溶液吸光值拟合线性方程，得到的标准曲线如图2所示，根据样品溶液和空白溶液吸光值计算其itl浓度，计算磁微粒表面氨基基团含量（计算方法同上）。

实施例3本发明方法的性能测定

采用本发明配制的3#bca试剂测试5种批次磁珠的氨基含量，具体数据见下表1：

表1不同批次磁珠平行测定10次相对标准偏差

从表1可以看出，本发明配制的试剂和测定方法具有灵敏度高、稳定性好的优点，不同批次磁珠平行测定10次相对偏差在5%以内。