一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法与流程

本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法。

背景技术：

利福昔明是一种半合成抗生素药，属于利福霉素类，缺乏系统活性，主要是具有极少的全身吸收的肠选择性抗生素。它针对革兰氏阳性病原体和革兰氏阴性病原体都具有广谱活性，并且由于其缺乏吸收，因而具有很好的耐受性。临床上主要用于治疗对利福昔明敏感的病原菌引起的肠道感染、作为手术前后的肠道预防用药及肝性脑病的辅助治疗。

目前，已有文献报道的利福昔明有关物质及含量测定的方法主要为反相高效液相色谱法，采用辛基键合硅胶或十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相均为甲醇-乙腈-磷酸盐/枸橼酸盐系统。利福昔明在现行中国药典及欧洲药典中均有收载，中国药典有关物质及含量测定的方法采用辛基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-磷酸盐/枸橼酸盐系统，和文献基本一致；欧洲药典有关物质及含量测定的方法采用十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-甲酸铵系统。

在进行实验研究后，在满足现行中国药典系统适用性试验要求的前提下，1个样品的运行时间约为120分钟(见图1)。欧洲药典的运行时间约为35分钟(图2)。并且，现行方法均较难实现杂质a、利福昔明y+羟基利福昔明的分离。如何缩短单次样品分析时间、提高色谱分离效能、提高质量控制效率是需要解决的一个问题。

目前已有文献报道，采用超临界流体色谱法分析利福平中的有关物质，该方法4分钟内即可实现利福平和5个主要杂质的分离，和常规反相高效液相色谱相比，大大缩短了分析时间。

超临界流体色谱法(sfc)是指以超临界流体为流动相的一种色谱类型。在分析化学领域，其可作为气相色谱和高效液相色谱的有力补充。对于少数药物的分离和定量，目前传统的气相色谱法或者高效液相色谱法还存在较多困难，如分离效能偏低、灵敏度不高、有机试剂消耗量大等，而采用sfc方法可有效提高分离效能和灵敏度，减小有机试剂消耗量且可大大缩短分离时间；同时sfc方法所用改性剂为co2，更为绿色环保。

在上述分析利福平中的有关物质方法中，采用甲醇(含0.1％甲酸铵和2％水)-二氧化碳为流动相，虽然可以快速实现利福平有关物质的分析，但其存在以下问题：多次进样后，存在系统压力逐渐升高直至超过仪器耐受的最高压力的情况，不适合大量样品的分析。这可能是甲酸铵在有机相中溶解度较低，在系统内逐渐析出所致。

综合以上可知，现有利福昔明原料及其制剂方法分析方法具有如下缺点：

1)分析时间长，特别是中国药典收录方法：运行1个样品的分析时间约为120分钟，不利于生产企业内控检测；

2)杂质a、利福昔明y+羟基利福昔明不能分离；

3)流动相需要大量的甲醇、乙腈，分析成本较高且对环境不友好；

4)流动相特别是中国药典采用的流动相含有高浓度缓冲盐，不能和质谱仪直接串联，不利于直接推测杂质的可能结构。

因此，建立一种通用、快速、高效、分离效能好的分析方法对于考察、评价及筛选利福昔明原料质量进而提高其后续制剂的质量非常必要。

技术实现要素：

为了克服现有技术的问题，本发明在分析现有分析方法的基础上，结合目前市场上利福昔明及其制剂的生产工艺，以二氧化碳和低级醇为流动相，开发了一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法，其采用超临界流体色谱法实现快速检测利福昔明制剂中有关物质及其含量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法，该检测方法为超临界流体色谱法，其包括如下步骤：

步骤1)采用有机溶剂溶解所述利福昔明原料或制剂制备样品；

步骤2)采用co2、低级醇作为流动相，在色谱柱中对所述样品进行梯度洗脱；

步骤3)采用检测器对所述样品的组分及其含量进行测定；

其中，所述样品的组分包括利福昔明和杂质，所示杂质包括2-氨基-4-甲基吡啶、利福霉素b、利福霉素sv、利福昔明y、利福霉素s、利福霉素o、杂质a、杂质b、羟基利福昔明中的任一种或任几种。

上述利福昔明和杂质的结构如下表所示：

表1利福昔明及各已知杂质的结构和来源

为了进一步优化上述利福昔明原料及其制剂组分的检测方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述利福昔明制剂包括利福昔明的混悬剂、胶囊、注入剂、片剂，也可为本领域常用的任一合适的制剂形式。

进一步地，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇中的至少一种，也可为其他任一合适的有机溶剂；所述低级醇包括甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种；其中，原料或制剂采用有机溶剂溶解后所获得的样品中利福昔明的浓度为5～10mg·ml^-1。

进一步地，所述低级醇为乙醇或乙醇和异丙醇的混合物；其中，异丙醇的混合比例为0～50v％。优选地，所述低级醇为乙醇和异丙醇的混合物，其中异丙醇的混合比例为10v％，上述异丙醇的比例可根据实际样品中的利福霉素b的洗脱时间做适当调整。

进一步地，所述低级醇的ph值为3.1～10.2，其采用的ph调节剂包括甲酸、冰醋酸、三氟乙酸、氨溶液。优选地，所述低级醇的ph值为5.0～7.5。

进一步地，所述色谱柱的填料活性基团为二醇基，色谱柱柱温为35～60℃，背压为1500～2500psi。优选地，色谱柱柱温为35℃，背压为2000psi。本发明表1中各组分结构的主要差异为极性取代基差异如羟甲基、羧基、酚羟基等；同时快速实现分离难度较高。本发明在分析上述组分结构的基础上，选择二醇基作为固定相，基于不同极性取代基和二醇基基团之间作用力大小的差异实现分离，选择性更好。

进一步地，所述色谱柱的进样体积为1～4μl，流速为0.8～1.5ml·min^-1，检测波长为220～260nm。优选地，所述色谱柱的进样体积为2μl，流速为1.2ml·min^-1，检测波长为240nm±2nm。

进一步地，所述流动相为：流动相a为二氧化碳，流动相b为乙醇-异丙醇；其中，所述乙醇-异丙醇的比例为90：10(v/v)。

进一步地，梯度洗脱条件为：0-1.8min，b10％-18％，1.8-4min，b18％-35％，4-6min，b35％-50％，6-7min，b50％，维持1min，7.1min后到b10％。

进一步地，所述检测器为upcc合相色谱仪，其配备有紫外检测器、二元梯度泵、自动进样器。

进一步地，使用的色谱柱为torusdiol(3.0mm×100mm，1.7μm)。也可采用其他合适的色谱柱，流速可调整为与选择色谱柱尺寸相适应的流速。进样体积可调整为与色谱柱载样量或检测器响应相适应的进样量。

进一步地，所述利福昔明的检测限为1μg·ml^-1。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

本发明所述的快速检测利福昔明原料及其制剂中有关物质及其含量的方法不仅可以缩短分析时间，提高企业内控检测的速度；并且可实现中国药典杂质a、利福昔明y+羟基利福昔明的分离及其他副产物和降解杂质之间及利福昔明和其相邻杂质之间的分离；而且该方法减小有机试剂如甲醇和乙腈的消耗量，更为绿色环保；更为重要的是该方法可以与质谱仪直接串联，利于未知杂质的结构推测。

本发明提供的检测方法专属性良好，分析速度快(10分钟以内)，重复性良好，利福昔明合成工艺中可能引入的杂质、工艺副产物及降解杂质间及利福昔明和相邻杂质间的分离度均良好，流动相为co2及少量醇，环境友好，可直接和质谱仪联用，便于杂质的结构推测，对于评价利福昔明原料的质量及其制剂的生产提供高效的数据支持，并可以在工艺评价和质量一致性评价研究中发挥重要作用。

附图说明

图1为利福昔明及其杂质的混合对照品溶液在中国药典利福昔明项下色谱系统条件下的典型色谱图；其中，色谱峰1、2-氨基4-甲基吡啶；2、杂质a+利福昔明y+羟基利福昔明(共洗脱)；3、利福霉素b；4、利福霉素sv；5、利福昔明；6、利福霉素s；7、杂质b。

图2为利福昔明及其杂质的混合对照品溶液在欧洲药典利福昔明项下色谱系统条件下的典型色谱图；其中，色谱峰1、2-氨基4-甲基吡啶；2、利福霉素b；3、利福霉素sv；4、杂质a+利福昔明y+羟基利福昔明(共洗脱)；5、利福昔明；6、利福霉素s；7、利福霉素o；8、杂质b。

图3为本发明一实施例中利福昔明及其杂质的混合对照品溶液的upcc典型色谱图；其中，色谱峰1、利福霉素s；2、利福霉素o；3、2-氨基-4-甲基吡啶；4、杂质b；5、利福昔明；6、杂质a；7、利福霉素sv；8、利福霉素b。

图4～6分别为不同来源(分别以a、b和c表示)利福昔明原料在本发明一实施例中的典型色谱图；其中，图4(来源a)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、杂质a、4、利福昔明y+羟基利福昔明；5、来源a工艺特有副产物；其中，图5(来源b)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明；其中图6(来源c，原研)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明。

图7～8分别为在本发明另一实施例中利福昔明含量测定的典型色谱图。

图9～11分别为不同来源的利福昔明片在本发明又一实施例中的典型色谱图；其中，在图9中(原料来源a的利福昔明片)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明；4、来源a工艺特有副产物；其中，在图10中(原料来源b的利福昔明片)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明；其中，图11中(原料来源c的利福昔明片)中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明。

图12为利福昔明胶囊在本发明又一实施例中的典型色谱图；其中，色谱峰1、未知杂质；2、杂质b；3、利福昔明；4、利福昔明y+羟基利福昔明。

图13为利福昔明软胶囊在本发明又一实施例中的典型色谱图；其中，色谱峰1、杂质b；2、利福昔明；3、利福昔明y+羟基利福昔明；4、未知杂质。

图14为本发明一实施例中ph3.1时的利福霉素b色谱图。

图15为本发明一实施例中ph10.2时的利福霉素b色谱图。

图16为本发明一实施例中为验证检测限的色谱图。

具体实施方式

本发明涉及一种利福昔明原料及其制剂组分的检测方法，该检测方法为超临界流体色谱法，其包括如下步骤：步骤1)采用有机溶剂溶解所述利福昔明原料或制剂制备样品；步骤2)采用co2、低级醇作为流动相，在色谱柱中对所述样品进行梯度洗脱；步骤3)采用检测器对所述样品的组分及其含量进行测定；其中，所述样品的组分包括利福昔明和杂质，所示杂质包括2-氨基-4-甲基吡啶、利福霉素b、利福霉素sv、利福昔明y、利福霉素s、利福霉素o、杂质a、杂质b、羟基利福昔明中的任一种或任几种。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中采用的仪器为：watersupcc合相色谱仪，配备紫外检测器、二元梯度泵、自动进样器；电子天平(cp225d，德国sartorius公司)。

其中，使用的色谱柱为torusdiol(3.0mm×100mm，1.7μm)；检测波长为240nm；流速：1.2ml·min^-1；进样体积：2μl；柱温：35℃；背压：2000psi。

流动相a为二氧化碳，流动相b为乙醇-异丙醇(90:10)；梯度洗脱条件为：0-1.8min，b10％-18％，1.8-4min，b18％-35％，4-6min，b35％-50％，6-7min，b50％(维持1min)，7.1min后到b10％；

利福昔明原料有关物质的检测。

1.混合对照品溶液的制备：分别取杂质a、杂质b、利福昔明及2-氨基-4-甲基吡啶、利福霉素b、利福霉素sv、利福霉素s、利福霉素o各适量，用乙醇溶解，配制成利福昔明浓度为5mg·ml^-1，其他杂质浓度均约为50μg·ml^-1的混合溶液。

2.样品溶液的制备：取3个来源(来源a、b、c)的利福昔明原料，分别用乙醇溶解，配制成5mg·ml^-1的溶液。

按照上述的仪器及试验方法，进样分析。

混合对照品溶液及3个来源的利福昔明原料实验结果见图3～图6。

对照例1

本对照例为利福昔明及其杂质的混合对照品溶液在中国药典记载的色谱系统条件下的利福昔明原料有关物质的检测。

其采用实施例1中的混合对照品溶液，根据中国药典记载的色谱系统条件，对上述混合对照品溶液进行检测，其检测所得典型色谱图如图1所示。

对照例2

本对照例为利福昔明及其杂质的混合对照品溶液在欧洲药典记载的色谱系统条件下的利福昔明原料有关物质的检测。

其采用实施例1中的混合对照品溶液，根据欧洲药典记载的色谱系统条件，对上述混合对照品溶液进行检测，其检测所得典型色谱图如图2所示。

根据上述实施例1、对照例1～2，由图4～5可知来源为a的原料和来源为b、c的原料杂质谱不同。由图1知，中国药典分析方法项下，先于利福昔明洗脱的杂质之间分离度较差；杂质a和利福昔明y+羟基利福昔明共洗脱；杂质b洗脱时间过长。由图2知，和中国药典色谱系统相比，欧洲药典色谱系统单次样品运行时间显著缩短；但仍存在杂质a和利福昔明y+羟基利福昔明共洗脱的问题。由图3和图4知，在超临界流体色谱系统中，单次样品运行时间大大缩短，降低为10分钟以内；可以兼顾利福昔明和已知杂质之间的分离；由图4知，主要工艺杂质利福昔明y+羟基利福昔明(共洗脱色谱峰)可以和杂质a实现良好的分离。且来源a的样品检出含量较高的特有工艺副产物，该杂质与利福昔明y+羟基利福昔明分离良好。

由上述实施例1可知，本发明建立的色谱分离系统，可以快速、高通量实现利福昔明的分离分析，且可以区分不同工艺来源的原料，为生产企业生产工艺的监控提供技术保障，为制剂质量一致性评价研究提供依据。

实施例2

本实施例为利福昔明原料含量的检测，其实验条件同实施例1。

样品溶液的制备：取利福昔明原料，分别用乙醇溶解，配制成0.5mg·ml^-1的溶液。

按照上述试验方法，进样分析。

对照品溶液的典型色谱图如图7所示，利福昔明原料典型色谱图如图8所示(以来源b为例。)

由该实施例可知，本发明建立的色谱分离系统，可以快速检测原料含量，可以为质量监测提供数据支持，为后续制剂的生产等提供依据。

实施例3

本实施例为试验条件同实施例1，其分别为利福昔明片、胶囊及软胶囊有关物质的检测。

样品溶液的制备：

利福昔明片：取利福昔明片，研细，取适量，用乙醇溶解制成5mg·ml^-1的溶液，过滤，取续滤液。

利福昔明胶囊：取利福昔明胶囊内容物适量，用乙醇溶解制成5mg·ml^-1的溶液，过滤，取续滤液。

利福昔明软胶囊：取利福昔明软胶囊，用乙醇冲洗内容物至适宜容量瓶中，并定量稀释制成5mg·ml^-1的溶液，过滤，取续滤液。

按照上述试验方法，进样分析。

典型色谱图见图9～图13。

图9～11分别采用原料来源a、原料来源b、原料来源c的利福昔明片，在图9中，其色谱峰1为杂质b，2为利福昔明，3为利福昔明y和羟基利福昔明，4为来源a工艺特有副产物；图10～图11中，色谱峰1为杂质b，2为利福昔明，3为利福昔明y和羟基利福昔明。图12采用原料来源b的利福昔明胶囊，其色谱峰1为未知杂质，2为杂质b，3为利福昔明，4为利福昔明y和羟基利福昔明。图13采用原料来源b的利福昔明软胶囊，其色谱峰1为杂质b，2为利福昔明，3为利福昔明y和羟基利福昔明，4为未知杂质。

由图9～13可知，利福昔明制剂有关物质色谱图中主要杂质和相应来源原料中主要杂质基本一致。利福昔明胶囊中在杂质b前出现原料中未检出的杂质，利福昔明软胶囊在利福昔明y和羟基利福昔明后出现原料中未检出的杂质，可通过和质谱仪串联进一步确认。

实施例4

本实施例研究了改性剂的种类对利福昔明和杂质a之间的分离度和利福霉素b的色谱保留行为的影响。

由图3知，利福霉素b在所有已知杂质中为强保留杂质。不同的改性剂主要影响利福昔明和杂质a之间的分离度和利福霉素b的色谱保留行为。以利福昔明浓度为5mg·ml^-1，杂质a和利福霉素b的量为1％为例，考察了不同类别改性剂对利福昔明和杂质a之间的分离度和利福霉素b色谱保留的影响。

表2不同改性剂对分离度和利福霉素b保留行为的影响

由本实施例的研究表明：可根据待检测利福昔明及其制剂中杂质种类及利福昔明的浓度选择适宜的改性剂。本发明实施例1中采用的色谱分离系统以乙醇-异丙醇(90:10)为改性剂，利福昔明浓度为5mg·ml^-1，保证了难分离物质对的分离度和强保留杂质在适宜的时间洗脱。

实施例5

本实施例研究了不同ph条件下利福霉素b色谱峰保留行为，其实验条件同实施例1，仅采用了不同的ph值。本实施例的实验结果如图14和图15所示。由图14知，利福霉素b峰型较宽，可能在该ph条件下，利福霉素b与二醇基作用力较强所致。由图15知，利福霉素b峰型较尖锐。

由本实施例的研究表明：改性剂ph值主要影响利福霉素b的保留行为和峰型。分别考察了不同ph值(3.1～10.2)对利福霉素b保留时间及峰型的影响。结果显示ph值升高，利福霉素b保留减弱，峰型尖锐。因此，本发明ph范围为3.1～10.2，根据色谱填料性质，优选为5.0～7.5。

实施例6

本实施例验证了采用本发明的检测方法的利福昔明的检测限，其实验条件同实施例1，其实验结果如图16所示。

由该实施例可知，有关物质测定时，样品浓度为5mg·ml^-1，利福昔明检测限约为1μg·ml^-1，相当于0.00002％，灵敏度高(图16)。本发明进样量为2μl，可以根据选择的仪器的定量环大小调节样品浓度和进样量。

由上述实施例可知，本发明建立的色谱分离系统，以低级醇和二氧化碳为流动相，避免了大量有机溶剂的使用，分析成本低，降低了有机溶剂对身体和环境的伤害；重要的是和原料生产工艺相关的主要副产物、降解杂质及和制剂相关的主要工艺杂质之间分离良好，响应较高，利福昔明和上述杂质之间分离良好；分析时间短，大大提高分析效率，可以较好的反映和监控制剂过程及贮藏过程中利福昔明制剂的质量；可以和质谱直接串联，对未知杂质进行鉴定并分析和生产工艺的相关性，为工艺的改进提供依据。

本发明实施例提供的检测方法，可以用超临界流体色谱完成利福昔明原料及其制剂有关物质及含量测定的检测，具有快速、高通量的优点。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。