一种用于葡萄汁真伪鉴定的液相色谱-同位素质谱联用方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于葡萄汁真伪鉴定的液相色谱-同位素质谱联用方法。

背景技术：

葡萄及其制品含有多种生物活性成分(糖类，有机酸，多酚类，氨基酸等)，具有抗氧化延缓衰老，对降低动脉硬化、心血管疾病、帕金森病、癌症、白内障等的发生率都具有重要作用，因而深受消费者的喜欢。市面上销售的葡萄汁品牌及品种繁多，价格参差不齐，不少厂家为牟取高额利润常添加廉价的糖或糖浆，却仍然标榜采用纯正葡萄汁原料，损害消费者的权益和健康，因此很有必要发明一种简单高效的检测技术实现葡萄汁掺假的快速鉴定，以保证葡萄汁产品的高质量及其市场的健康发展。

目前国内果汁掺假检测的方法多基于分析其中的特征成分(糖类，有机酸，芳香及挥发性组分等等)。事实上，葡萄汁中的主要成分是糖，其他成分的含量相对较低，且有机酸的含量也受不同品种及成熟度的影响，因而葡萄汁的掺假分析可以围绕其中糖类物质的分析。对于果汁中添加外源糖的检测，可借鉴的方法包括红外光谱法、同位素分析法，核磁分析法和色谱法。其中红外检测可鉴定的糖浆有限，核磁分析成本过高，同位素分析或结合色谱法分析是当前的主流方法，准确度很高。最新报道有利用元素分析-碳同位素比值质谱法，通过分析其中糖类及有机酸的δ¹³c值来鉴定真假葡萄汁，但是样品处理涉及有机酸的沉淀，过程复杂，试剂消耗多。

针对上述不足，现需要一种用于葡萄汁真伪鉴定的液相色谱-同位素质谱联用方法，不仅简便快捷，且成本低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于葡萄汁真伪鉴定的液相色谱-同位素质谱联用方法，不仅简便快捷，且成本低。

本发明提供了如下的技术方案：

一种用于葡萄汁真伪鉴定的液相色谱-同位素质谱联用方法，其步骤如下：

s1、纯正葡萄汁制备：采购企业或大型超市销售的新鲜、饱满、无病斑、整粒的葡萄，不经特殊处理后榨取纯正葡萄汁并冷冻保存备用。

s2、葡萄汁样品准备：采购不同超市来源的不同品牌的市售葡萄汁(纯正或添加糖)。

s2、分别称取一定量的s1和s2中的葡萄汁(0.2-0.4mg)，超纯水稀释定容至20ml，充分涡旋，经水相滤膜过滤后进行液相－同位素比质谱分析。

s3、使用survey液相色谱仪与deltavadvantage同位素质谱仪(美国thermoscientific公司)联用检测，其中液相色谱(hplc)条件包括：色谱柱：rezexrcm-monosaccharideca²⁺(7.8*300mm)；柱温：80℃；流动相：超纯水；流速：350μl/min；氧化剂(0.14mol/l过硫酸钠溶液和0.34mol/l磷酸溶液)流速：50μl/min；氧化炉温度：99.9℃；进样体积：6-12μl。同位素质谱(irms)条件包括：电子轰击离子源(electronimpactionsourceei)；氦气purge压力：1.4bar；氦气carrier压力：2.0bar；二氧化碳压力：0.5bar；离子源电压：3.06kv；真空度：1.8×10^-6mbar；扫描方式：正离子扫描；测定质量数：44/45/46。

s4、仪器测定及进样：进样前仪器平衡至少15min，待流动相压力≤60bar，二氧化碳(44)背景值≤300mv，氧气(32)值≥5000mv，并进行refco2on/off测试，d¹³c/¹²cstd.dev.小于0.06‰，方可开始进样。

s5、葡萄汁样品中糖类物质的δ¹³c值的确定使用软件isodat3.0。δ¹³c值的计算基于国际标准物质viennapeedeebelemnitestandard(vpdb)，计算公式为：δ¹³c＝(rsample－rvpdb)/rvpdb×1000，其中rsample为样品的¹³c与¹²c的同位素比值¹³c/¹²c，rvpdb＝0.0112372。高纯co2参考气体的δ¹³c标定值为-17.80‰。

s6、确定判定葡萄汁真伪的规则，首先分析纯正葡萄汁的lc-irms色谱图，随后其中果糖和葡萄糖的δ¹³c的差值范围确定纯正葡萄汁的判定规则，如果市售葡萄汁中果糖和葡萄糖的δ¹³c差值不在这个范围内，则可视为掺假葡萄汁。

本发明的有益效果：

与现有葡萄汁掺假检测技术相比，本发明将不同的流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，并采用高效液相色谱仪与deltavadvantage稳定同位素比质谱仪联用设备(hplc-irms)，仪器灵敏度高，可行性强，只需在线测定葡萄汁中糖类组分的δ¹³c，采用的葡萄汁样品少，不仅样品处理简便快捷，无需明确掺假用糖浆来源，定性鉴别结果准确性高，且成本低。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为自制纯正葡萄汁的lc-irms色谱图；

图2为市售第一种真葡萄汁(标识无添加糖)的lc-irms色谱图；

图3为市售第二种假葡萄汁(标识无添加糖)的lc-irms色谱图；

图4为市售第三种假葡萄汁(标识无添加糖)的lc-irms色谱图；

图5为市售第一种假葡萄汁(标识无添加糖)的lc-irms色谱图；

图6为市售第二种假葡萄汁(标识添加糖)的lc-irms色谱图。

具体实施方式

实施例1

s1、纯正葡萄汁制备：真实葡萄汁原料来自于企业或大型超市，共选取50种新鲜、饱满、无病斑、整粒的葡萄，保留皮和籽，放入榨汁机中榨取纯正葡萄汁，分装好于-18℃下冷冻保存，备用。

s2、葡萄汁样品处理：30种鉴定分析用的市售葡萄汁样品(纯正或添加糖)分别采购于不同超市。

s3、对于所有葡萄汁，分别称量0.3mg，用超纯水定容到20ml，充分涡旋后经0.22μm水相滤膜过滤后进行液相－同位素比质谱分析。

s4、实验仪器：survey液相色谱仪、deltavadvantage同位素质谱仪：(美国thermoscientific公司)

s5、液相色谱(hplc)条件：色谱柱：rezexrcm-monosaccharideca²⁺(7.8*300mm)；柱温：80℃；流动相：超纯水；流速：350μl/min；氧化剂(0.14mol/l过硫酸钠溶液和0.34mol/l磷酸溶液)流速：50μl/min；氧化炉温度：99.9℃；进样体积：8μl。

s6、同位素质谱(irms)条件：电子轰击离子源(electronimpactionsourceei)；氦气purge压力：1.4bar；氦气carrier压力：2.0bar；二氧化碳压力：0.5bar；离子源电压：3.06kv；真空度：1.8×10^-6mbar；扫描方式：正离子扫描；测定质量数：44/45/46。

s7、仪器测定：进样前仪器平衡至少15min，待流动相压力≤60bar，二氧化碳(44)背景值≤300mv，氧气(32)值≥5000mv，并进行refco2on/off测试，d¹³c/¹²cstd.dev.小于0.06‰，方可开始进样。

s8、葡萄汁样品的δ¹³c值的确定使用软件isodat3.0。δ¹³c值的计算基于国际标准物质viennapeedeebelemnitestandard(vpdb)，计算公式为：

δ¹³c＝(rsample－rvpdb)/rvpdb×1000，其中rsample为样品的¹³c与¹²c的同位素比值¹³c/¹²c，rvpdb＝0.0112372。高纯co2参考气体的δ¹³c标定值为-17.80‰。

s9、典型的纯正葡萄汁液相色谱-碳同位素比值质谱所得碳同位素44/45/46的离子流图见附图1。

s10、葡萄汁真伪的判定规则：纯正葡萄汁首先不能检测到二糖，其中果糖和葡萄糖的δ¹³c的差值范围δδ¹³cf-g为0.1‰～1.64‰，如果市售葡萄汁中果糖和葡萄糖的δ¹³c差值不在这个范围内，则可视为掺假葡萄汁，各类型待测葡萄汁样品的液相色谱-碳同位素比值质谱所得碳同位素44/45/46的离子流图分别见附图2-6。

实施例2

s1、纯正葡萄汁制备：真实葡萄汁原料来自于企业或大型超市，共选取50种新鲜、饱满、无病斑、整粒的葡萄，保留皮和籽，放入榨汁机中榨取纯正葡萄汁，分装好于-18℃下冷冻保存，备用。

s2、葡萄汁样品处理：30种鉴定分析用的市售葡萄汁样品(纯正或添加糖)分别采购于不同超市。

s3、对于所有葡萄汁，分别称量0.35mg，用超纯水定容到20ml，充分涡旋后经0.22μm水相滤膜过滤后进行液相－同位素比质谱分析。

s4、实验仪器：survey液相色谱仪、deltavadvantage同位素质谱仪：(美国thermoscientific公司)

s5、液相色谱(hplc)条件：色谱柱：rezexrcm-monosaccharideca²⁺(7.8*300mm)；柱温：80℃；流动相：超纯水；流速：350μl/min；氧化剂(0.14mol/l过硫酸钠溶液和0.34mol/l磷酸溶液)流速：50μl/min；氧化炉温度：99.9℃；进样体积：10μl。

s6、同位素质谱(irms)条件：电子轰击离子源(electronimpactionsourceei)；氦气purge压力：1.4bar；氦气carrier压力：2.0bar；二氧化碳压力：0.5bar；离子源电压：3.06kv；真空度：1.8×10^-6mbar；扫描方式：正离子扫描；测定质量数：44/45/46。

s7、仪器测定：进样前仪器平衡至少15min，待流动相压力≤60bar，二氧化碳(44)背景值≤300mv，氧气(32)值≥5000mv，并进行refco2on/off测试，d¹³c/¹²cstd.dev.小于0.06‰，方可开始进样。

s8、葡萄汁样品的δ¹³c值的确定使用软件isodat3.0。δ¹³c值的计算基于国际标准物质viennapeedeebelemnitestandard(vpdb)，计算公式为：

δ¹³c＝(rsample－rvpdb)/rvpdb×1000，其中rsample为样品的¹³c与¹²c的同位素比值¹³c/¹²c，rvpdb＝0.0112372。高纯co2参考气体的δ¹³c标定值为-17.80‰。

s9、典型的纯正葡萄汁液相色谱-碳同位素比值质谱所得碳同位素44/45/46的离子流图见附图1。

s10、葡萄汁真伪的判定规则：纯正葡萄汁首先不能检测到二糖，其中果糖和葡萄糖的δ¹³c的差值范围δδ¹³cf-g为0.1‰～1.64‰，如果市售葡萄汁中果糖和葡萄糖的δ¹³c差值不在这个范围内，则可视为掺假葡萄汁，各类型待测葡萄汁样品的液相色谱-碳同位素比值质谱所得碳同位素44/45/46的离子流图分别见附图2-6。

本发明的优点：

本发明将不同的流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，并采用高效液相色谱仪与deltavadvantage稳定同位素比质谱仪联用设备(hplc-irms)，仪器灵敏度高，可行性强，只需在线测定葡萄汁中糖类组分的δ¹³c，采用的葡萄汁样品少，不仅样品处理简便快捷，无需明确掺假用糖浆来源，定性鉴别结果准确性高，且成本低。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。