一种测定土霉素钙预混剂中土霉素含量的方法与流程

本发明属于分析测试
技术领域：
，具体涉及一种测定土霉素钙预混剂中土霉素含量的方法。
背景技术：
：土霉素钙预混剂作为一种饲料添加剂，是土霉素生产菌的全发酵液与适量碳酸钙制成的土霉素钙盐，其活性成分为土霉素。在兽药国家标准中，土霉素钙预混剂含量采用微生物检定法进行测定。实践表明，采用微生物法测定含量有几个弊端：1)方法的影响因素多，对含量测试的准确度有较大的影响；2)方法繁琐，耗时较长，造成工作效率低；3)测试成本较高。这些缺陷，制约着工业化生产土霉素钙预混剂生产进程和质量控制，造成生产效率低，质量控制不稳定。鉴于上述情况，急需一种既能准确可靠检测土霉素钙预混剂含量检测，又能提高检测效率并降低检验成本的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种测定土霉素钙预混剂中土霉素含量的方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1、一种测定土霉素钙预混剂中土霉素含量的方法，所述方法为高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱：c18；柱温：30-40℃；检测波长：270-380nm；流动相：浓度为2mmol/l的磷酸溶液与n,n-二甲基甲酰胺按体积比780-820:180-220混合后形成的混合液；泵流量：0.8-1.2ml/min；进样体积：20μl；运行时间：15-25min。优选的，所述高效液相色谱法具体包括如下步骤：(1)配制土霉素标准储备溶液：取土霉素标准品用浓度为0.05mol/l的hcl溶液稀释配制浓度为500μg/ml的土霉素标准储备溶液，备用；(2)配制土霉素工作标准品溶液：以步骤(1)中土霉素标准储备溶液为母液用浓度为0.05mol/l的hcl溶液稀释配制浓度为100μg/ml的土霉素工作标准品溶液，过0.22μm滤膜，备用；(3)配制土霉素供试品溶液：取土霉素钙预混剂样品用浓度为0.05mol/l的hcl溶液稀释配制土霉素供试品溶液，过0.22μm滤膜，备用；所述土霉素供试品溶液中土霉素的理论浓度为0.4-500μg/ml；(4)利用高效液相色谱仪测试：取相同体积的土霉素工作标准品溶液和土霉素供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照权利要求1所述的色谱条件进行高效液相色谱分析；利用峰面积外标法进行含量计算，计算公式如下：公式中：a供：为土霉素供试品溶液图谱中土霉素的峰面积；a工：为土霉素工作标准品溶液图谱中土霉素标准品的峰面积；m标：为土霉素标准储备溶液中土霉素标准品的质量；m供：为土霉素供试品溶液中土霉素钙预混剂样品的质量；n％：为土霉素标准储备溶液中土霉素标准品的质量百分比。优选的，步骤(3)中，所述土霉素供试品溶液中土霉素的理论浓度为100μg/ml。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种测定土霉素钙预混剂中土霉素含量的方法，该方法为高效液相色谱分析法，不仅大大地提升了检测速度及精度，同时还节约了检验成本，具体为：(1)实现了土霉素含量的快速准确的测定，最长每25min可完成一次数据采集，相比微生物检定法，检测效率提高数百倍，同时大大降低了样品的检验成本。(2)重复性好，连续6次进样测定同一个样品，测得土霉素含量的rsd可达0.05％，而使用微生物检定法测定，一般6次测定的rsd在3％左右。(3)再现性好，由不同检验员、在不同日期使用不同仪器，分别对同一批土霉素钙预混剂样品检测检测6次，检测结果总体rsd可达0.44％，远远小于常规要求的rsd不大于5％的要求。(4)准确度高，通过回收率测试可知，土霉素的回收率可达99.2-100.4％，符合常规要求的回收率95-105％范围。(5)较宽的线性测试范围，土霉素在0.5-250μg/ml的浓度范围内(相当于土霉素钙预混剂中含土霉素0.1-50wt％)具有良好的线性相关性，相关系数可达0.9996。(6)定量限与检出限，土霉素的定量限可达0.07wt％，检出限为0.018wt％，完全满足测定样品的要求。(7)耐用性好：在一定范围内，改变柱温，改变流量，改变流动相比例，改变色谱柱批次进行系统适应性试验，rsd均小于1.0％，柱效，分离度，拖尾因子均符合要求。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为实施例2中土霉素钙预混剂样品的高效液相典型色谱图；图2为本发明中土霉素工作标准品溶液的高效液相色谱图；图3为实施例5中土霉素工作标准品溶液在浓度0.5-250μg/ml范围内的线性回归分析曲线。具体实施方式下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。测试过程中所使用的试剂及药品：纯化水(hplc级)、盐酸(优级纯)、磷酸(优级纯)、n,n-二甲基甲酰胺(色谱纯)；配制2.0mol/l盐酸溶液：量取浓盐酸84ml用纯化水稀释至500ml；配制0.05mol/l盐酸溶液：量取2mol/l盐酸25ml用纯化水稀释至1000ml；配制2mol/l磷酸溶液：量取磷酸135ml用纯化水稀释至1000ml；配制2mmol/l磷酸溶液：取2mol/l磷酸溶液0.8ml，加入纯化水稀释至800ml。配制土霉素标准储备溶液：精密称定土霉素标准品25.0mg，转移至50ml的容量瓶中，用0.05mol/lhcl溶解，并稀释至刻度，摇匀后于冰箱中2-8℃下保存备用；配制土霉素工作标准品溶液：取上述土霉素标准储备溶液5ml于25ml容量瓶中，用0.05mol/lhcl稀释至刻度，配制成土霉素工作标准品溶液，过0.22μm滤膜，备用；土霉素供试品溶液按如下方法配制：取规格为20wt％的土霉素钙预混剂样品，精密称定50mg，转移至100ml的容量瓶中，用0.05mol/l盐酸将样品浸润，然后再用0.05mol/lhcl稀释至刻度，于磁力搅拌器上搅拌30min，过0.22μm滤膜，备用。检测仪器及条件：岛津lc-20a系列及lc-2010cht型高效液相色谱仪；色谱条件：色谱柱：c18，填料粒径5μm，色谱柱的孔径和长度为4.6×100mm/150mm；柱温：35℃；检测波长：280nm；流动相：浓度为2mmol/l的磷酸溶液与n,n-二甲基甲酰胺按体积比800:200混合后形成的混合液；泵流量：1.00ml/min；进样体积：20μl；运行时间：18min。实施例1系统适应性测试取上述配制的土霉素工作标准品溶液，连续进行5次分析，进行方法的系统适应性测试，即对色谱参数峰面积的重复性(rsd)、柱效(n)、拖尾因子(t)分离度(r)进行测试，测试结果统计于下表1。表1系统适应性参数测试结果统计平行分析峰面积柱效(n)拖尾因子(t)分离度(r)1347585931381.42.82347963031611.42.83346180131701.32.74345191931651.32.75344626931801.32.7平均值346309531631.32.7s14543///rsd％0.42///由表1可知，系统适应性参数测试结果均符合常规要求。实施例2样品重复性测试取上述配制的土霉素工作标准品溶液，按照上述土霉素供试品溶液配制方法以同一批土霉素钙预混剂为样品配制6份土霉素供试品溶液，进行6次测定，均按如下方法进行测试：将相同体积的土霉素工作标准品溶液和土霉素供试品溶液，注入岛津lc-20a型高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析，记录6次测定土霉素的保留时间及峰面积，通过公式：进行土霉素含量计算，结果见表2。其中该批土霉素钙预混剂样品的高效液相典型色谱图，如图1所示；土霉素工作标准品溶液高效液相色谱图，如图2所示。表2样品重复性测试数据统计表土霉素供试品溶液保留时间土霉素峰面积土霉素含量(％)15.921403939020.7225.930403829520.7235.936403811620.7245.944403803520.7155.947404090520.7365.962404351220.74平均值5.940403970920.72标准偏差0.01421600.010rsd60.24％0.053％0.048％由表2可知，连续6次测定同一个土霉素供试品溶液，土霉素峰保留时间的rsd为0.24％；峰面积rsd为0.053％；测得含量的rsd为0.048％，符合rsd不大于2.0％的要求。实施例3样品再现性测试再现性又称方法精密度，通过不同的检验员在不同日期使用不同的仪器对同一样品进行检测来确定。取上述配制的土霉素工作标准品溶液，按照上述土霉素供试品溶液配制方法以同一批土霉素钙预混剂为样品配制6份土霉素供试品溶液(分别由两名检验员在不同的日期分别配制，并分别在岛津lc-20系列型(仪器1)及lc-2010cht型高效液相色谱仪(仪器2)上注射)，进行6次测定，均按如下方法进行测试：将相同体积的土霉素工作标准品溶液和土霉素供试品溶液，注入仪器中，按照上述色谱条件进行分析测定，通过公式：进行土霉素含量计算，并记录测定结果，统计分析测定结果的rsd，见表3。表3样品再现性(方法精密度)测试数据统计分析由表3可知，由不同检验员、在不同日期使用不同仪器，分别对同一批土霉素钙预混剂样品检测6次，检测结果总体rsd为0.44％，符合常规的rsd不大于3％的要求。实施例4样品准确度测试准确度是测定值与真实值之间的接近程度，通常以回收率来表示方法的准确度。选择一已知规格的土霉素钙预混剂样品(土霉素含量为20.57wt％，)，用0.05mol/lhcl稀释，分别配制3个浓度级别的土霉素钙预混剂样品溶液，每个级别配制3份，共9份，进行9次分析测定，每次均按照上述色谱条件进行，然后通过公式：进行土霉素含量计算，并记录测定结果，进而计算每次测定土霉素的回收率(测定值/理论值)，结果见下表4。表4准确度测试数据统计由表4可知，土霉素的回收率为99.2-100.4％，符合回收率在95-105％的要求。实施例5线性及其范围测试配制不同浓度的一系列土霉素工作标准品溶液(间隔范围包含被测试样的最低值与最高值)，分别进行注射测定，对测定数据进行线性回归分析。将上述土霉素标准储备溶液进行稀释，以土霉素工作标准品溶液为中心(相对浓度100％)，进行浓度的缩小和扩大，配制11个浓度级别的土霉素工作标准品溶液，其最终稀释浓度见下表5，范围从0.5-250μg/ml。将11个浓度的工作标准品溶液均按照上述色谱条件进行分析测试，分别记录响应峰面积，将各浓度与响应峰面积进行线性回归分析。回归分析曲线如图3所示，线性拟合得到回归方程为：y＝0.00003x+1.2699，计算得到线性相关系数r2为0.9996。测试分析结果见表5。表5土霉素线性及范围测试数据由表5可知，土霉素在0.5-250μg/ml的浓度范围内(相当于土霉素钙预混剂中含金霉素0.1-50wt％)具有良好的线性相关性，相关系数为0.9996。实施例6检出限与定量限测定通常以信噪比(s/n)为10时对应的检测浓度作为定量限，以信噪比(s/n)为3时对应的检测浓度作为检出限。在实施例5中土霉素线性范围内最低浓度的基础上，对土霉素工作标准品溶液继续进行稀释测定，测试结果表明，浓度为0.35μg/ml时的信噪比(s/n)为10，即把此浓度作为定量限(相当于0.07wt％)；浓度为0.09μg/ml时的信噪比(s/n)为3，即把此浓度作为检出限(相当于0.018wt％)。实施例7耐用性测试通过对色谱条件进行微小的改变，再次进行系统适应性测试，来考查方法的耐用性，看能否达到预期的接受标准(分峰面积的rsd≤2％)。本试验是通过如下条件的改变分别进行方法的耐用性考查，测试结果见表6。1)改变柱温，分别在35℃±5℃的条件下进行试验。2)改变流速，分别在1.00±0.1ml/min的流速下进行试验。3)改变流动相比例，在流动相成分变化±10％的条件下进行试验，应符合接受标准，具体试验条件按如下两种情况进行：流动相1：2mmol/l磷酸溶液/n,n-二甲基甲酰胺，体积比为780：220流动相2：2mmol/l磷酸溶液/n,n-二甲基甲酰胺，体积比为820：1804)改变色谱柱，使用不同批次的色谱柱(长度分别为100mm和150mm)进行试验。表6方法耐用性试验统计由表6可知，通过如上色谱条件的改变再次进行系统适应性测定，测定结果均符合接受标准(峰面积与保留时间的rsd均不大于2％)，这表明该方法是相对稳定、耐用的。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。当前第1页12