一种中药材龙胆和坚龙胆的鉴别和区分方法与流程

本发明涉及一种中药材龙胆和坚龙胆的鉴别和区分方法，属于中药成分鉴别
技术领域：
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背景技术：
：龙胆为龙胆科植物条叶龙胆（gentianamanshuricakitag.）、龙胆（gentianascabrabge.）、三花龙胆（gentianatriflorapall.）或坚龙胆（gentianarigescensfranch）的干燥根和根茎。具有清热燥湿，泻肝胆火的功效，用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐。龙胆始载于东汉《神农本草经》，列为中品，历代本草均有收载。目前，龙胆为42种保护的野生植物药材品种之一，4个基源的龙胆均是国家三级重点保护野生药材品种，属于资源严重减少的主要常用野生药材物种。目前条叶龙胆和三花龙胆产量低，栽培面积小，唯有龙胆和坚龙胆栽培面积较大，是中药材龙胆原料的主要来源。市场上家种龙胆年产量较坚龙胆少，其有效成分龙胆苦苷含量较高，南龙胆（坚龙胆）虽然种植面积大，但其龙胆苦苷含量较低，因此，龙胆市场价格要明显高于坚龙胆。近年来，一些龙胆的商品药材中时常掺入坚龙胆及一些伪品，造成龙胆质量的参差不齐，因此建立一种快速、准确、客观、简单的鉴别和区分中药材龙胆gentianascabrabge.和坚龙胆gentianarigescensfranch.的方法有重要的意义。目前，鉴别方法包括传统方法和与现代科技结合的色谱方法。现阶段，传统的眼看、口尝、鼻闻、手摸等简便方法由于主观性强，在中药材鉴别已非常局限，而色谱方法诸如uv、ir、nir、tlc中存在大量的假阳性和假阴性问题，容易导致结论的偏差，另外一些已存在的试图鉴别龙胆和坚龙胆的hplc法，由于方法复杂，区别点不明确，或者样品不具备代表性，难以做到高效、快速、准确的区分。因此，本发明通过采用高效液相色谱法(hplc法）建立龙胆的特征图谱，能快速，准确的鉴别和区分龙胆和坚龙胆药材。技术实现要素：本发明的目的是提供一种中药材龙胆（gentianascabrabge）和坚龙胆（gentianarigescensfranch）的区分鉴别方法，应用高液相色谱法(hplc法）建立龙胆的特征图谱，鉴别和区分龙胆和坚龙胆两种不同基源的中药材，简单、快速、准确。为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：一种中药材龙胆和坚龙胆的区分鉴别方法，包括如下步骤：（1）采用hplc法建立龙胆和坚龙胆的特征图谱；（2）根据药材在hplc特征图谱中呈现的特征峰值不同，判定其为龙胆或坚龙胆；步骤（1）所述的龙胆和坚龙胆hplc特征图谱的建立方法，包括如下步骤：（1）参照物溶液的制备：取龙胆苦苷对照品、獐牙菜苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸各100µg的混合溶液，即得；（2）供试品溶液的制备：取过四号筛的本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，加热回流15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；（3）测定：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5µm）；以乙腈为流动相a，0.1%醋酸水溶液为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.80ml；柱温为30℃；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000；步骤（2）所述的龙胆药材在hplc特征图谱中应呈现6个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间一致；与龙胆苦苷参照物峰相对应的峰为s峰，计算特征峰4，5，6的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：1.07（峰4），2.18（峰5），2.24（峰6）；与坚龙胆区别点：在hplc特征图谱中，特征峰4与峰5之间，不出现峰高大于峰6的色谱峰；步骤（2）所述的坚龙胆药材在hplc特征图谱中呈现5个特征峰，与龙胆苦苷参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间：其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：1.07（峰4），2.14（峰5）；与龙胆的区别点：在hplc特征图谱中，峰4和峰5之间，出现峰高大于峰5的色谱峰。龙胆和坚龙胆药材特征图谱具体见附图1。图1龙胆药材hplc特征图谱，该特征图谱中应呈现6个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间一致；与龙胆苦苷参照物相对应的峰为s峰，计算特征峰4，5，6的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：1.07（峰4），2.18（峰5），2.24（峰6）；以此鉴别为龙胆药材；图1坚龙胆药材hplc特征图谱，该特征图谱中呈现5个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相一致；与龙胆苦苷参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间：其相对保留时间应该在规定值的±10％之内；规定值为：1.07（峰4），2.14（峰5）；以此来鉴别为坚龙胆药材；坚龙胆和龙胆的区分（图中黑圈标记）：龙胆特征图谱中在特征峰4和5之间无明显高于峰6的色谱峰。坚龙胆特征图谱中，特征峰4和5之间出现峰高明显高于峰5的色谱峰。本发明的有益效果是：现阶段，龙胆与坚龙胆的鉴别和区分主要从性状、含量测定等方面，而这些方面特征性不强，差异不大，容易造成错误的判断。而本发明能从根本上快速、准确的鉴别和区分龙胆和坚龙胆，具有一定的特征性。附图说明图1为龙胆药材hplc对照特征图谱和坚龙胆药材hplc对照特征图谱；图2为20批龙胆药材特征图谱叠加图；图3为17批坚龙胆药材特征图谱叠加图；图4特征峰1、2和3采用对照品参照物溶液指认。具体实施方式下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例我们采集了来自黑龙江，吉林，辽宁三个产地共20批次符合2015年《中国》药典规定的龙胆药材以及来自贵州、云南两个主产区，5个产地的共17批符合2015年《中国》药典规定的坚龙胆（坚龙胆）药材，测定其特征图谱；具体方法如下：色谱条件色谱柱：agilenteclipsexdb-c18，以乙腈为流动相a，0.1%醋酸水为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长：240nm，柱温：30℃。参照物溶液的制备取龙胆苦苷对照品、獐牙菜苦苷对照品、马钱苷酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸各100µg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，加热回流15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果20批龙胆药材测定结果如下：以3号峰龙胆苦苷为参照，计算其余各峰的相对保留时间，实验结果见下表2所示。表220批龙胆（龙胆）药材特征图谱各特征峰的相对保留时间序号峰1峰2峰3（s）峰4峰5峰610.6170.8141.0001.0692.2542.31320.6160.8141.0001.0692.2572.31430.6150.8091.0001.0702.2062.26340.6170.8151.0001.0702.2592.31850.6160.8101.0001.0702.2092.26760.6170.8131.0001.0692.2432.30170.6140.8081.0001.0712.2122.27080.6150.8081.0001.0702.2062.26390.6160.8091.0001.0692.2102.267100.6160.8101.0001.0692.2182.275110.6160.8091.0001.0692.2102.268120.6160.8101.0001.0692.2132.271130.6140.8091.0001.0702.2152.275140.6150.8091.0001.0682.2092.267150.6140.8071.0001.0702.2032.260160.6140.8071.0001.0712.1972.254170.6140.8071.0001.0702.1962.253180.6080.8021.0001.0722.1432.198190.6080.8011.0001.0732.1362.191200.6090.8051.0001.0722.1542.210均值0.6140.8091.0001.0702.2082.265rsd（%）0.460.450.000.121.511.5217批坚龙胆测定结果如下：以3号峰龙胆苦苷为参照，计算其余特征峰的相对保留时间，实验结果见下表3。表317批坚龙胆药材特征图谱的相对保留时间序号药材批号峰1峰2峰3（s）峰4峰51gp17071610.6040.7971.0001.0742.1472gp17071620.6030.7961.0001.0752.1413gp17071630.6030.7971.0001.0762.1444gp17071640.6040.7971.0001.0742.1485gp17071650.6040.7971.0001.0742.1476gp17080650.6040.7981.0001.0742.1527gp17080680.6040.7971.0001.0732.1508gp17080690.6040.7971.0001.0742.1479gp18060220.6000.7941.0001.0772.12510gp18060230.6010.7941.0001.0772.12311gp18060240.6010.7941.0001.0772.11812gp18060810.6000.7941.0001.0782.11513gp18060820.6000.7941.0001.0772.11714gp18060830.6000.7941.0001.0772.11615gp18067010.6010.7951.0001.0752.12716gp18067020.6020.7961.0001.0732.13417gp18067030.6020.7951.0001.0742.133均值0.6020.7961.0001.0752.134　rsd（%）0.280.190.000.140.63%结果显示，20批龙胆药材特征图谱均呈现出6个特征峰，其中峰1、2、3分别与参照物溶液中的马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷保留时间一致，另外3个特征峰的相对保留时间分别均在1.07±10%（峰4），2.18±10%（峰5），2.24±10%（峰6）范围内。龙胆药材特征峰4和5之间，无峰高大于峰6的特征峰。17批坚龙胆药材特征图谱均呈现出5个特征峰，其中峰1、2、3分别与对照品参照物溶液中的马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷保留时间一致，另外2个特征峰的相对保留时间分别均在1.07±10%（峰4），2.14±10%（峰5）范围内。龙胆药材特征峰4和5之间，出现峰高大于峰6的特征峰；以此来实现龙胆、坚龙胆药材的鉴别与区分。当前第1页12