一种分离分析大体积环境水样中四环素类抗生素的方法与流程

本发明属于环境样品痕量目标物分离分析技术领域，特别涉及一种分离分析大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的方法。该方法将静电纺丝纳米纤维与高效液相色谱联用，适用于环境水样及其他复杂基体中痕量四环素类抗生素目标物的萃取、富集、分离和检测。

背景技术：

四环素类抗生素(tcs)由一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物产生，属于氢化并四苯环衍生物的广谱抗生素，在350nm附近可见光区表现出强紫外吸收和荧光性质，包括土霉素(otc)、四环素(tc)、金霉素(ctc)以及强力霉素(dc)等。这类抗生素抗菌活性相似，都能抑制细菌蛋白质合成，在高浓度下杀菌作用明显，由于其抗菌谱比较宽，被广泛用于革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌、细胞内衣原体、螺旋体和立克次氏体以及支原体所引起的感染，在动物传染疾病治疗和预防方面具有很高的的应用价值。一般地，为了加速畜禽的生长和保证畜禽的抗病能力，抗生素可作为饲料添加剂。此外，在人类医学方面，四环素类抗生素主要用于立克次体病、衣原体病、支原体病、螺旋体病的临床治疗，还可以治疗许多疾病，比如四环素局部注射治疗婴儿乳糜胸、鞘膜积液、癌性心包积液、恶性肿瘤诊断、治疗支气管胸膜瘘和食管静脉曲张出血等。但是，抗生素使用不当或者滥用抗生素会造成非常严重的危害，过量使用会使tcs通过动物排泄物残留在环境水中，tcs进入环境以后，经过水的稀释作用，多以痕量和超痕量存在，因此建立环境水体中tcs的检测方法是很有必要。

目前，检测复杂基质中tcs痕量残留的方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、微生物法、免疫分析法、毛细管电泳法等，其中，高效液相色谱-荧光分析联用法(hplc-fl)具有分析速度快、灵敏度高、分析效能高等特点，因而被广泛应用于tcs的检测中。

固相萃取(solidphaseextraction，spe)是一个由色谱分离过程、分离机理、固定相和溶剂的选择等组成的试样预处理技术，其利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标物，使目标物与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，最终达到分离和富集目标物的目的。spe具有操作时间短、样品量小、不需萃取溶剂、适于分析挥发性与非挥发性物质、重现性好等优点.对环境化学、食品、医药卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域中复杂目标物样品微量或痕量的分离、富集和分析做出了巨大的贡献。

静电纺丝技术(electrospinning)作用原理基于高压静电场的激发，聚合物溶液或者熔体在两电极间发生高速发散喷射。高压直流或者交流电作用在导电溶液或熔体上，使得喷丝针头与收集装置之间形成一个高压静电场，在高压静电的作用下，聚合物溶液中的同性电荷聚集在液滴表面，电荷密度增加，位于喷丝针头末端的液滴首先会形成圆锥状的taylor锥，当电场强度超出某一临界值后，电荷之间的库仑斥力大于液滴表面张力，针头末端的液滴则会克服液体自身的表面张力和粘弹性力，以发散状流体射出。溶剂挥发或者熔体冷却固化后即可在接收装置上形成纳米或亚微米数量级的聚合物纤维。静电纺丝技术制得的纳米纤维具有极大比表面积(是常规纤维的上千倍)、较高孔隙率、直径小、长径比大以及纤维精细非常均匀等优点。在目前纳米技术研究中，静电纺丝技术仍然是实现纳米级聚合物纤维连续纺织的唯一有效方法。该技术在科研领域中将占据着重要的位置并能为人们创造出更多的利益与成果，在分离介质、吸收材料、生物组织工程、催化剂载体等领域也显示出较好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中纤维膜材料在种类和萃取效果上的很多不足，提供一种分离分析大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的方法。

具体步骤为：

(1)将0.07660gna2so3和7.4074g马来酸酐加入到三口烧瓶中，再加入13.15ml密度为0.8060g/ml的丙烯腈和20ml去离子水，用市售稀硫酸调节溶液ph至2.0，在氮气保护下加热至60℃后向内加入0.1360g的k2s2o8，反应3小时，取出白色聚合物用水和无水乙醇冲洗3-5次，过滤后置于真空干燥箱中60℃下干燥12小时，即得到pancma聚合物。

(2)将2.0g步骤(1)所得pancma聚合物在微波消解仪(温度70℃，时间10分钟，功率300w)辅助下溶解于50ml分析纯n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，另称取0.3g氧化石墨烯(go)溶解于15.0ml分析纯dmf中超声分散15分钟，将其与上述溶液混合即得纺丝液。

(3)用2.5ml注射器吸取2ml步骤(2)所得纺丝液，将注射器置于恒流泵上固定好，夹紧针头，流速调节为0.02ml/min，调节电压为13.6kv左右，接收距离25cm，相对湿度20-50％，温度35-50℃进行纺丝，即制得pancma-go电纺丝纳米纤维。

(4)在400ml环境水样品中加入1.2ml分析纯甲酸使环境水样品呈酸性，将步骤(3)制得的pancma-go电纺丝纳米纤维浸没到上述环境水样品溶液中，在磁力搅拌下以800r/min的转速下搅拌5分钟，萃取并富集环境水样品中存在的痕量四环素类抗生素。

(5)采用体积比为2:4:4分析纯甲酸/无水甲醇/分析纯三氯甲烷混合溶液洗脱富集在步骤(4)pancma-go电纺丝纳米纤维上的四环素类抗生素，收集洗脱液用氮吹仪吹干，之后用1.0ml体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液重新溶解，所得溶液收集到进样瓶，用高效液相色谱-荧光光谱联用分析测定，即实现对大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的分离分析。

通过定量分析可知，四种抗生素的线性方程见表1。

表1：四种抗生素的线性方程

其中：y为峰面积；x为抗生素的浓度，ng/ml；r²为相对标准偏差。

本发明方法至少具有以下优点：

1)本发明方法采用静电纺丝法制备了新型pancma-go电纺丝纳米纤维，纤维材料比表面积大，官能团裸露率高，配以go更多的含氧官能团，苯环使其对tcs具有更好的吸附性能。本发明方法操作简单、重复性好、灵敏度高，检测结果可靠，可应用于各种环境水样品中痕量tcs的准确检测。

2)经过pancma聚合物、go比例、纺丝电压，接收距离、流速的调控的优化，使所得纳米纤维直径更细、更均匀，纳米纤维中的go含量不断增加，获得了吸附性更强、吸附量更大、吸附速率更快、稳定性和重现性更好的电纺丝纳米纤维，可应用于复杂水体样品中痕量四环素类抗生素的选择性萃取、富集和分析；并采用高效液相色谱-荧光光谱仪(hplc-fld)方法进行定性定量分析，实现了大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的高灵敏、痕量的准确分析。

附图说明

图1是本发明中pancma的合成和整个富集过程的简略示意图。

图2是本发明静电纺丝过程示意图。

图3是本发明富集环境水中tcs的具体流程图。

图4是本发明实施例制得的pancma-go电纺丝纳米纤维在放大倍数为1000倍下的扫描电子显微镜图。

图5是本发明实施例制得的pancma-go电纺丝纳米纤维在放大倍数为3000倍下的扫描电子显微镜图。

图6是本发明实施例中pancma-go电纺丝纳米纤维与hplc-fld联用分离分析tcs色谱图；其中：a是鱼塘水样品未经电纺丝纳米纤维富集的hplc-fld色谱图，b是鱼塘水样品通过电纺丝纳米纤维富集后的hplc-fld色谱图，c是四种抗生素的标准色谱图。

具体实施方式

为更进一步阐释本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳的实施例，对依据本发明提出的一种分离分析大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的方法及其应用具体实施方式、方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。

实施例：

(1)pancma共聚物的合成

将0.0766gna2so3和7.4074g马来酸酐加入到三口烧瓶中，再加入13.15ml密度为0.8060g/ml的丙烯腈和20ml去离子水，用市售稀硫酸调节溶液ph至2.0，在氮气保护下加热至60℃后向内加入0.1360g的k2s2o8，反应3小时，取出白色聚合物用水和无水乙醇冲洗3次、过滤、静置于真空干燥箱中(60℃)干燥12小时，即得到pancma聚合物，反应过程见图1。

(2)氧化石墨烯的合成

本实验通过hummers法制备氧化石墨烯。该方法分为三个阶段：

①低温反应：将烧杯放入4℃以下冰水浴中，在磁力搅拌的情况下加入110ml浓h2so4，插入温度计，待烧杯中温度下降至4℃，依次加入5g鳞片状石墨和2.5g的nano3，然后缓慢加入15g的kmno4，加完后记时，控制反应时间为90分钟，此时溶液呈紫绿色。

②中温反应：将大烧杯移入温水浴中反应，控制烧杯中的反应温度为32～40℃，不断搅拌继续反应30分钟，此时溶液呈紫绿色。

③高温反应：中温反应结束之后，往烧杯中慢慢加入200ml去离子水，持续加热保持反应温度为70～100℃左右，缓慢加入25ml体积百分比浓度为5％的双氧水进行高温反应，此时溶液从黑褐色变为鲜亮的黄褐色，反应结束。采用离心机将得到的产物进行多次离心洗涤，用bacl2检测直到无白色沉淀生成，说明产物中没有so4^2-的存在，将制得的氧化石墨置于55℃下真空干燥过夜得氧化石墨烯(go)。

(3)pancma-go电纺丝纳米纤维的制备

将2.0g步骤(1)所得pancma聚合物在微波消解仪(温度70℃，时间10分钟，功率300w)辅助下溶解于50ml分析纯n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，另称取0.3g氧化石墨烯(go)溶解于15.0ml分析纯dmf中超声分散15分钟，将其与上述溶液混合即得纺丝液，搭建静电纺丝装置如图2所示，用2.5ml注射器吸取2ml纺丝液，将注射器置于恒流泵上固定好，夹紧针头，流速调节为0.02ml/min，调节电压为13.6kv左右，接收距离25cm，相对湿度20-50％，温度35-50℃，即得到最终的电纺丝纳米纤维。所得pancma-go电纺丝纳米纤维表面显微结构如图4、图5所示。

(4)pancma-go电纺丝纳米纤维萃取富集四环素类抗生素

聚丙烯腈基电纺丝富集装置如图3所示。取400ml样品置于500ml烧杯中，将缠有聚丙烯腈基电纺丝的金属棒固定在硬纸板上调节长度，使得电纺丝纳米纤维完全浸没在样品溶液中。富集前，首先用15ml无水甲醇、5mlph＝5的甲酸-氨水缓冲液轮流冲洗填充柱材料，以除掉残留的杂质，平衡萃取柱。调节磁力搅拌器转速为800r/min，搅拌5分钟；将缠有聚丙烯腈基电纺丝的金属棒取出浸没进10ml洗脱液(体积比为2:4:4分析纯甲酸/无水甲醇/分析纯三氯甲烷),搅拌2分钟，萃取液经氮吹仪吹干后用体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液重新溶解后过0.22μm尼龙膜进行hplc检测分析。

将实施例制得的pancma-go电纺丝纳米纤维与hplc-fld联用分离分析池塘水中四环素类抗生素的含量。

首先从桂林市会仙镇郊某鱼塘里内取5l水，静止沉积大颗粒杂质，然后过0.45μm滤膜，取400ml水样，加入1.2ml分析纯甲酸使水样呈酸性，将制得的电纺丝纳米纤维浸入水样溶液中，在磁力搅拌下以800r/min的转速下搅拌5分钟；之后用10ml体积比为2:4:4分析纯甲酸/无水甲醇/分析纯三氯甲烷混合溶液洗脱富集在pancma-go电纺丝纳米纤维上的四环素类抗生素，收集洗脱液用氮吹仪吹干，之后用1.0ml体积百分比浓度为90％的甲醇水溶液重新溶解，所得溶液收集到进样瓶，用高效液相色谱-荧光光谱联用分析测定，即实现对大体积环境水样中痕量四环素类抗生素的分离分析；结果表明，该鱼塘里水中otc、tc、dc、ctc的检出限分别达0.092、0.0653、0.1088、0.5375ng/ml，详细结果见表3。

在上述实例中，是采用鱼塘水样品作为研究对象来证实本发明所制备的pancma-go电纺丝纳米纤维的高萃取富集能力。但以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术内容方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

表2：pancma-go电纺丝纳米纤维对四环四类抗生素的萃取率(n＝3)

表3：pancma-go电纺丝纳米纤维-hplc-fld联用分离分析池塘水中

四环四类抗生素含量及回收率结果(n＝3)