特异性识别赭曲霉毒素A的POSS有机-无机杂化分子印迹整体柱及其制备方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱及其制备方法。

背景技术：

分子印迹整体柱（molecularimprintedmonolithiccolumn，mipmc）是近年来发展迅速的一种新型色谱填料整体柱。其色谱填料大孔聚合物介质通过原位聚合方法合成即由单体、引发剂、交联剂及致孔剂溶液在空管柱中聚合制得。分子印迹整体柱具有制备过程简单、传质速度快、重复性好、柱压低等优点，是一种非常具有应用潜力的色谱固定相，因而受到了人们越来越多的重视。分子印迹整体柱根据其制备方法和原料的不同分为三类：有机分子印迹聚合物整体柱、无机分子印迹整体柱和有机-无机杂化分子印迹整体柱。有机分子印迹聚合物整体柱具有出色的ph稳定性和各种单体的易得性。然而，当暴露于不同的流动相时，这些材料可能会收缩或膨胀，并且不同溶剂中的不同程度的溶胀可能会显著改变聚合物网络的形态；无机分子印迹整体柱具有良好的光学性能、机械性能以及化学惰性，但无机分子印迹整体柱不可避免地存在裂解和收缩，并且溶胶-凝胶过程难以控制等问题。而有机-无机杂化分子印迹整体柱则可以成功克服有机分子印迹整体柱和无机分子印迹整体柱的缺点。

多面体低聚倍半硅烷（poss）具有独特的笼状结构，由于其易于化学改性、良好的ph耐受性、耐高温、抗氧化等优点，已经作为功能单体或交联剂被广泛应用于杂化整体材料的制备。自从li课题组首次将poss用于制备分子印迹整体柱，基于poss的印迹材料得到越来越多的关注（jchromatogra.2015，1425，180-188）。利用poss单体，尤其是乙烯基poss是提高所得印迹聚合物亲和性、简化制备过程的有效方法。然而，目前基于poss印迹整体柱的报道还很少，其优点还没有得到充分的论证。特别是，目前还没有乙烯基poss杂化整体柱结合分子印迹技术、一锅法制备对赭曲霉毒素a（ota）具有特异性识别分子印迹整体柱的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱及其制备方法。该整体柱负载量大、特异性强，机械性能稳定，制备方法简便快捷。是由通过“一步聚合”的方式，采用致实现高亲水有机聚合单体、交联剂、模板、引发剂以及二元致孔剂五种组分的高度兼容，利用柱内自由基热引发聚合反应实现了快速、高效率、稳定的分子印迹整体柱的制备，所得到的分子印迹杂化整体柱可实现对目标物的高效识别，且对啤酒基质中目标物的回收率可达96.6%。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱是将高亲水有机聚合单体、交联剂、模板、引发剂和二元致孔剂为原料，溶解形成均一的溶液，注入柱内通过发生自由基热引发聚合而直接形成。

上述的高亲水有机聚合单体为：2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体；交联剂为：笼型低聚倍半多聚硅氧烷和丙烯酸酯；上述的模板为赭曲霉毒素a溶液；上述的引发剂为：偶氮二异丁氰；上述二元致孔剂为：n,n-二甲基甲酰胺和peg10000；

进一步的，上述笼型低聚倍半多聚硅氧烷与丙烯酸酯的质量比为1:（20-25）；所述二元致孔剂，其组成按质量百分比计为：n,n-二甲基甲酰胺93.5%-96.5%，peg100003.5%-6.5%；

更进一步的，所述笼型低聚倍半多聚硅氧烷为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述述丙烯酸酯为乙二醇二甲基丙烯酸酯；

进一步的，高亲水有机聚合单体与交联剂的质量比为：10.7:85.3-14.7:89.3；

进一步的，二元致孔剂在高亲水有机聚合单体、交联剂和致孔剂三者总质量中所占质量百分比为75-83%；模板的用量为高亲水有机聚合单体和交联剂两者总质量质量百分比的25%-26%；模板中赭曲霉毒素a浓度为250-1000ppb；引发剂的用量为高亲水有机聚合单体和交联剂两者总质量质量百分比的0.9%-1.1%；

特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱的制备方法，包括以下步骤：

（1）石英毛细管柱预处理：将熔融石英毛细管分别用0.1mol/lhcl冲洗30min，用蒸馏水冲洗30分钟，用0.1mol/lnaoh冲洗3小时，用蒸馏水和甲醇分别冲洗30分钟，然后在室温下以0.4mpa氮气干燥30min；为了将c=c键引入毛细管内表面以键合杂化基质，将体积百分比为50%的γ-maps甲醇溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶密封，然后将毛细管放在60℃的水浴锅中水浴加热24h；之后，用甲醇冲洗毛细管30min，然后在70℃下通过0.4mpa氮气干燥30min以供进一步使用；

（2）将高亲水有机聚合单体、交联剂和引发剂加入到离心管中，再将二元致孔剂和模板加入至离心管中，室温下涡旋振荡20-30min，超声脱气20-30min，使其形成均匀的溶液；

（3）将步骤（2）得到的溶液在室温下注入步骤（1）预处理好的石英毛细管柱中，两端密封后浸入50-60℃水浴连续反应10-15h；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇洗去模板和未反应的物质直至压力稳定；

（4）将缓冲液通入步骤（3）所制得的整体柱中，于4℃温度下保存。

上述缓冲液的组成为：10mmol/ltris-hcl，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl和20mmol/lcacl2，ph为8.5。

本发明所述的特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱在啤酒、葡萄酒、果汁饮品实际样品中赭曲霉毒素a成分的分离和富集中的应用。但是所述饮品种类不仅限于以上种类。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明将poss基整体柱与分子印迹技术相结合制备了特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱；

（2）本发明制备的分子印迹整体柱可以实现对赭曲霉毒素a特异性分离；

（3）本发明制备的分子印迹整体柱对ota的最大负载量为5.9ng（100μmi.d.×10cm）；

（4）本发明制备的分子印迹整体柱能够被用于啤酒中赭曲霉毒素a的高效富集与分离，其检测回收率达96.6%。

附图说明

图1为分子印迹整体柱的扫描电镜图；左700倍，右2000倍。

图2为分子印迹整体柱的特异性测试；a：为非分子印迹对照柱，b：为分子印迹整体柱；otb：赭曲霉毒素a；ota：赭曲霉毒素a。

图3为分子印迹整体柱的穿透曲线图。

图4为分子印迹整体柱的机械稳定性；bindingbuffersolution：结合缓冲液；meoh：甲醇；acn：乙腈；h2o：水；eluantsolution：洗脱液。

图5为分子印迹整体柱对啤酒中赭曲霉毒素a的特异性测试。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱及其制备方法，具体步骤为：

（1）石英毛细管柱预处理：将熔融石英毛细管分别用0.1mol/lhcl冲洗30min，用蒸馏水冲洗30分钟，用0.1mol/lnaoh冲洗3小时，用蒸馏水和甲醇分别冲洗30分钟，然后在室温下以0.4mpa氮气流干燥30min；为了将c=c键引入毛细管内表面以键合杂化基质，将体积百分比为50%的γ-maps甲醇（v/v）溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶密封，然后将毛细管放在60℃的水浴锅中水浴加热24h；之后，用甲醇冲洗毛细管30min，然后在70℃下通过0.4mpa氮气干燥30min以供进一步使用；

（2）按质量比为12.7:3.8:83.5的比例，准确称量2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷和乙二醇二甲基丙烯酸酯加入到离心管中，准确加入引发剂的用量占单体和交联剂两者总质量质量百分比的1.0%，准确加入二元致孔剂的量为在高亲水有机聚合单体、交联剂和致孔剂三者总质量中所占质量百分比为79%，依次加入至2.0ml离心管中，然后将模板的用量占单体和交联剂两者总质量百分比的25.5%的赭曲霉毒素a浓度为500ppb的模板加入至离心管中，室温下涡旋振荡20min，超声脱气20min，使其形成均匀的溶液；

（3）将步骤（2）得到的溶液在室温下注入步骤（1）预处理好的石英毛细管柱中，两端密封后浸入55℃水浴连续反应12h；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇洗去模板和未反应的物质直至压力稳定，可得柱b；

（4）将缓冲液通入步骤（3）所制得的整体柱中，于4℃温度下保存。缓冲液的组成为：10mmol/ltris-hcl，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl和20mmol/lcacl2，ph为8.5。

实施例2

加入赭曲霉毒素a浓度为250ppb的模板，其他步骤如实施例1，可得柱a。

实施例3

加入赭曲霉毒素a浓度为750ppb的模板，其他步骤如实施例1，可得柱c。

实施例4

加入赭曲霉毒素a浓度为1000ppb的模板，其他步骤如实施例1，可得柱d。

实施例5

加入二元致孔剂的量在高亲水有机聚合单体、交联剂和致孔剂三者总质量中所占质量百分比为75%，其他步骤如实施例1，可得柱e。

实施例6

加入二元致孔剂的量在高亲水有机聚合单体、交联剂和致孔剂三者总质量中所占重量百分比为83%，其他步骤如实施例1，可得柱f。

实施例7

加入按质量比为14.7:3.7:81.6的比例的2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷和乙二醇二甲基丙烯酸酯，其他步骤如实施例1，可得柱g。

实施例8

加入按质量比为10.7:3.9:85.5的比例的2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸单体、甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷和乙二醇二甲基丙烯酸酯，其他步骤如实施例1，可得柱h。

表1poss有机-无机杂化赭曲霉毒素a分子印迹整体柱制备条件优化表

实施例9分子印迹整体柱的特异性测试

应用非分子印迹对照柱和实施例1所得分子印迹整体柱b检测对赭曲霉毒素a的特异性识别。柱长10cm，分别按以下步骤实施：（1）平衡：先用结合缓冲液平衡0.5小时，色谱条件为流速0.10ml/min，压力250psi，所述的结合缓冲液为10mmol/ltris-hcl，120mmol/lnacl，5mmol/lkcl和20mmol/lcacl2，ph8.50；（2）富集：将20μl终浓度为10ng/ml的赭曲霉毒素a(ota)和终浓度为100ng/ml赭曲霉毒素b（otb）的混合溶液分别注入两种柱子中，在整体柱上富集1小时，色谱条件为0.02ml/min，压力250psi；（3）清洗：将富集柱装到液相色谱泵上，用结合缓冲液对对照柱和分子印迹整体柱分别清洗；清洗条件为流速0.1ml/min，压力250psi，收集最后的清洗液待查；（4）洗脱：用乙酸:甲醇=2:98（v/v）作为洗脱液将赭曲霉毒素a从整体柱上洗脱下来，250psi反压阀，流速0.1ml/min收集20μl的洗脱液待查。采用hplc-荧光检测器上检测收集液，对照柱对赭曲霉毒素a没有特异性识别，且对赭曲霉毒素a和赭曲霉毒素b富集和洗脱效果较差（图2a），分子印迹整体柱中的ota可以被有效识别富集和洗脱下来（图2b）。

实施例10分子印迹整体柱的结合量测定

运用动态前沿分析法测定赭曲霉毒素a在本发明制备的特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱上的穿透曲线（breakthroughcurve），并以此计算整体柱的最大吸附量。将50ng/ml的ota溶液以0.02ml/min的流速经过10cm有效柱长的分子印迹整体柱用以计算该整体柱对目标物ota的最大负载（qmax），接收并测定每20μl的流出液中ota的峰面积绘制出穿透曲线图（图3）。从穿透曲线中可以确定，最大峰面积的中间点对应的体积（vr）为120μl，另外整体柱的空隙体积（v0）可根据公式v0=vtotal-vcapillary（其中，vtotal=μ×ttotal，μ表示毛细管柱内流动相的流速，t表示流动相穿过毛细管柱所用的时间，实验选用不保留物甲苯作为标记物）计算得到为v0=170nl，根据公式qmax=c（vr-v0）（c代表目标物ota的浓度（ng/ml））计算得到该分子印迹整体柱对ota的最大负载量为5.9ng（100μmi.d.×10cm）。

实施例11分子印迹整体柱的机械稳定性测定

采用实施例1制备的特异性识别赭曲霉毒素a的poss有机-无机杂化分子印迹整体柱置于微液相泵，在五种不同极性的流动相中（甲醇、水、acn、洗脱液、结合缓冲液），通过改变流速测定其变化与整体柱背压之间的关系。如图4所示，分子印迹整体柱在五种流动相中，流速与背压呈现良好的线性相关性，r²达到0.9927~0.99927，可见本发明所制备的分子印迹整体柱具有良好的机械稳定性。

应用实施例1

采用的实施例1中的分子印迹整体柱，测试其对啤酒中赭曲霉毒素a的富集效率。通过加标实验，将0.2ng/ml的赭曲霉毒素a标准溶液加入到啤酒中。实际啤酒样品中的ota可以被有效识别富集并洗脱下来（图5），ota在啤酒基质中的检测回收率为96.6±3.1%，3次测定的相对标准偏差为3.0%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。