一种利用指纹图谱对牙痛停滴丸进行质量控制的方法与流程

本发明涉及一种利用指纹图谱对牙痛停滴丸进行质量控制的方法。

背景技术：

牙痛(toothache)是指牙齿因各种原因如西医学的龋齿、牙髓炎、根尖周围炎和牙本质过敏等引起的疼痛，是口腔疾患中常见的症状之一。

常用的治疗牙痛的药物多为化学合成药中的非甾体抗炎药，此类药能有效的镇痛，但常常引起对胃肠道的刺激。由本申请人研发的牙痛停滴丸，具有止痛消肿的功效。用于风火牙痛；牙周炎及冠周炎引起的牙痛。能很好地缓解各种原因引起的牙痛，效果好，无不良反应。中药制剂目前存在的问题是质量难于控制，如何用一种简便、快捷、准确的方法对牙痛停滴丸进行质量控制，是亟需解决的一个难题。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种利用指纹图谱对牙痛停滴丸进行质量控制的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用指纹图谱对牙痛停滴丸进行质量控制的方法，包括如下步骤：

(a)参照物溶液的制备：精密称取丁香酚，加乙酸乙酯制成浓度1.0mg/ml的溶液，为参照物溶液；

(b)供试品溶液的制备：取牙痛停滴丸去包衣，置于研钵中研成粉末状，精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理20-40min，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液；

(c)气相色谱条件：色谱柱为以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，毛细管柱柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm；程序升温：初始温度为140℃，保持2分钟，再以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟；进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1；

理论塔板数按参照物丁香酚峰计算等于或大于80000；

(d)测定：

分别吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按照所述气相色谱条件测定，记录1小时色谱图；供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

优选地，色谱柱的型号为db-1柱。

本发明的优点：

本发明利用指纹图谱对牙痛停滴丸进行质量控制的方法，能稳定、精密、重现地对牙痛停滴丸进行质量控制。建立了牙痛停滴丸指纹图谱检测标准。

附图说明

图1为不同色谱柱的分离效果比对图。

图2为不同色谱条件的比对图。

图3为五种溶剂提取效果的比较图。

图4为丁香酚与供试品对比图。

图5为牙痛停滴丸2小时记录气相色谱图。

图6为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第1针)。

图7为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第2针)。

图8为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第3针)。

图9为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第4针)。

图10为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第5针)。

图11为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证精密度试验gc色谱图(第6针)。

图12为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第0小时)。

图13为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第2小时)。

图14为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第4小时)。

图15为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第6小时)。

图16为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第8小时)。

图17为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证稳定性试验gc色谱图(第24小时)。

图18为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第1份)。

图19为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第2份)。

图20为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第3份)。

图21为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第4份)。

图22为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第5份)。

图23为牙痛停滴丸(批号695017)分析方法验证重现性试验gc色谱图(第6份)。

图24为牙痛停滴丸(批号：697001)共有峰标定gc色谱图。

图25为牙痛停滴丸(批号：697002)共有峰标定gc色谱图。

图26为牙痛停滴丸(批号：697003)共有峰标定gc色谱图。

图27为牙痛停滴丸(批号：698001)共有峰标定gc色谱图。

图28为牙痛停滴丸(批号：698002)共有峰标定gc色谱图。

图29为牙痛停滴丸(批号：698003)共有峰标定gc色谱图。

图30为牙痛停滴丸(批号：698004)共有峰标定gc色谱图。

图31为牙痛停滴丸(批号：698005)共有峰标定gc色谱图。

图32为牙痛停滴丸(批号：698006)共有峰标定gc色谱图。

图33为牙痛停滴丸(批号：698007)共有峰标定gc色谱图。

图34为牙痛停滴丸gc对照指纹图谱峰2(s)：丁香酚。

图35为气相指纹图谱对比图(从上至下分别为：丁香油-荜茇膏-牙痛停滴丸)。

图36为局部放大图1(从上至下分别为：丁香油-荜茇膏-牙痛停滴丸)。

图37为局部放大图2(从上至下分别为：丁香油-荜茇膏-牙痛停滴丸)。

图38为牙痛停滴丸(生产批号：698010)共有峰标定gc色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

试验部分

1检测方法的研究

1.1色谱条件考察

1.1.1色谱柱的摸索

取牙痛停滴丸(批号695017)，去包衣，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，分别使用色谱柱db-1、db-5、db-17按如下方法进行测定，结果如图1。

色谱条件：初始温度60℃，保持5分钟；以每分钟10℃的速率升温至280℃，保持33分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

结果表明，色谱柱db-1及db-5所分离出的峰多于db-17，这是由于db-17色谱柱最高限制温度较低，因此在测定时只能升温至250℃，后面的色谱峰无法流出。同时由于db-1的分离效果最佳，最终确认db-1柱为实验用色谱柱。

1.1.2色谱条件优化

取牙痛停滴丸(批号695017)，去包衣，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，分别使用色谱条件1、2、3进行测定。结果如图2。

条件1：初始温度120℃，保持5分钟；以每分钟5℃的速率升温至280℃，保持23分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

条件2：初始温度140℃，保持5分钟；以每分钟5℃的速率升温至280℃，保持27分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

条件3：初始温度140℃，保持2分钟；以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

结果表明，条件3使基线走的更加平稳，峰的分离效果更好。最终确认条件为初始温度140℃，保持2分钟；以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

综上，确定的色谱条件为：以100％二甲基聚硅氧烷(db-1)为固定相的毛细管柱(柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm)毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度140℃，保持2分钟；以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟，进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。

1.2供试品前处理方法考察

1.2.1溶剂考察

取牙痛停滴丸(批号695017)，去包衣，研细，称取0.5g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、丙酮、正己烷、无水乙醇10ml，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，结果见图3。

实验结果表明乙醚挥发性太强，在提取过程中大量挥发，因此没有乙醚提取的色谱图。其他五种溶剂中，正己烷提取出的色谱峰少、峰面积小，提取效果不佳；丙酮和三氯甲烷可以使样品完全溶解，因此样品中的聚乙二醇也会进入气相色谱仪，给进样口和色谱柱造成负担；无水乙醇溶解性强易溶出色谱柱和进样口存在的高沸点杂质杂质，对色谱柱性能有不好影响，故选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

1.2.2提取时间

取牙痛停滴丸(批号695017)，去包衣，研细，称取0.5g，平行3份，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，分别超声处理20分钟、30分钟、40分钟，摇匀，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，结果见表1。

表1供试品不同提取时间的峰面积变化

实验结果表明：提取20分钟与提取30分钟、提取40分钟效果基本相同，因此优先选择提取时间为20分钟。

综上，确定的前处理方法为：取牙痛停滴丸去包衣，置于研钵中研成粉末状，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理20分钟，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液。(也可以超声明处理30分钟或40分钟)

1.3参照物的选择

为准确描述本品的指纹图谱(相对保留时间)，采用峰面积较大，较稳定的丁香酚峰为参照物峰。取丁香酚对照品适量，精密称定，置量瓶中，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为参照物溶液。见图4。

1.4色谱图记录时间的考察

取本品供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，照确定方法检测，记录2小时的色谱图，显示60分钟以后无色谱峰流出，结果见图5，因此确定色谱图记录时间为60分钟。

2方法学验证试验

2.1系统适应性

以100％二甲基聚硅氧烷(db-1)为固定相的毛细管柱(柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm)毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为140℃，保持2分钟；以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟；进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1。理论塔板数按参照物峰(丁香酚)计算，＝5.54(tr/w1/2)²＝97033。

因此，规定理论塔板数按参照物峰(丁香酚)计算应不低于80000。

2.2精密度

将本品(批号695017)去包衣，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理20分钟，摇匀，滤过，取续滤液。按照拟定的色谱条件进行测定，连续测定6次，结果见表2和表3，图6-11。

表2牙痛停滴丸指纹图谱考察精密度试验(相对保留时间)

表3牙痛停滴丸指纹图谱考察精密度试验(峰面积相对比值)

结果表明，牙痛停滴丸供试品溶液各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd＜3％)；各峰的相对峰面积基本一致(rsd＜3％)，精密度试验符合要求。

2.3稳定性取本品(批号695017)供试品溶液在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、24小时测定，记录分析各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表4和表5，图12-17。

表4牙痛停滴丸指纹图谱考察稳定性试验(相对保留时间)

表5.牙痛停滴丸指纹图谱考察稳定性试验(峰面积相对比值)

结果表明，牙痛停滴丸供试品溶液各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd＜3％)；各峰的相对峰面积基本一致(rsd＜3％)，表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.4重现性

将本品(批号695017)去包衣，研细，称取0.5g，平行6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理20分钟，摇匀，滤过，取续滤液。按照拟定的色谱条件进行测定，结果见表6和表7，图18-23。

表6牙痛停滴丸指纹图谱考察重现性试验(相对保留时间)

表7牙痛停滴丸指纹图谱考察重现性试验(峰面积相对比值)

结果表明，牙痛停滴丸供试品溶液各色谱峰的相对保留时间基本一致(rsd＜3％)；各峰的相对峰面积基本一致(rsd＜3％)，重现性试验符合要求。

以上测定结果表明，用本气相色谱法测定牙痛停滴丸指纹图谱的稳定性、精密度、重现性试验均符合要求，因此可选用该气相色谱法作为牙痛停滴丸指纹图谱的测定方法。

3指纹图谱及技术参数

3.1共有峰的标定

根据10批供试品气相色谱图所给出的相关参数，确定共有峰应有17个，各共有峰依次标号为1，2，…，n，其中参照物峰(丁香酚)标号为2(s)(图24-33)。

3.2共有峰相对保留时间

以2号峰(丁香酚)作为参照，计算10批供试品各共有峰相对保留时间及相对分面积比值，结果见表8。

表8共有峰相对保留时间

结果表明，相对保留时间具有较好的重现性，各共有峰相对保留时间与其均值的差值均小于0.4％。

3.3共有峰面积的比值

根据10批供试品气相色谱图谱所给出的相关参数，选择了17个共有峰，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、11号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰进行峰面积的比值比较；单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，为2号峰(参照物峰)；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，为15号峰；单峰面积占总峰面积大于或等于5％，而小于10％的共有峰，为3号峰；其它各峰单峰面积占总峰面积均小于5％。

本品指纹图谱中选择共有峰中峰面积相对较大，较稳定的色谱峰(2号共有峰)的峰面积作为1，计算其它各共有指纹峰面积的比值，见表9。

表9共有峰面积的比值

3.4非共有峰面积

非共有峰总面积占总峰面积的百分比值见表10，结果表明，非共有峰总面积占总峰面积百分比最大为4.20％。

表10非共有峰总面积占总峰面积百分比

3.5指纹图谱相似度

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”对牙痛停滴丸10批样品的色谱图进行计算和处理，得到各批次样品气相色谱对照指纹图谱(图34)，各批供试品与对照指纹图谱间的相似度均≥0.99。相似度结果见表11。

表11牙痛停滴丸10批图谱与对照指纹图谱相似度结果

注：样品号与批号对应表，表12.

表12样品号与批号对应表

4牙痛停滴丸色谱峰归属分析

对牙痛停滴丸、丁香油和荜茇膏进行色谱图比对(见图35-37)，对牙痛停滴丸对照指纹图谱中的17个共有峰进行归属。

从对比图中可以看出2号峰(参照峰、丁香酚)为丁香专属的色谱峰；1号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰(胡椒碱)、16号峰、17号峰为荜茇专属的色谱峰；3号峰、4号峰、5号峰为丁香和荜茇共有的色谱峰。

实施例1

一种利用指纹图谱对牙痛停滴丸(生产批号：698010)进行质量控制的方法，包括如下步骤：

(a)参照物溶液的制备：精密称取丁香酚，加乙酸乙酯制成浓度1.0mg/ml的溶液，为参照物溶液；

(b)供试品溶液的制备：取牙痛停滴丸去包衣，置于研钵中研成粉末状，精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯10ml，超声处理20min，摇匀，滤过，取续滤液，为供试品溶液；

(c)气相色谱条件：色谱柱为以100％二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，毛细管柱柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm；程序升温：初始温度为140℃，保持2分钟，再以每分钟4℃的速率升温至280℃，保持23分钟；进样口温度为280℃；检测器温度为300℃；分流进样，分流比20：1，色谱柱的型号为db-1柱

(d)测定：

分别吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，按照所述气相色谱条件测定，记录1小时色谱图(见图38)；供试品指纹图谱中呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.993。

理论塔板数按参照物丁香酚峰计算为95451。用超声处理的时间也可以选用30min或40min替代20min，测定的效果与本实施例的效果相似。