一种快速测定牡丹果荚中白藜芦醇活性成分含量的方法与流程

本发明涉及一种快速的分析检测方法，一种利用超高效液相色谱-质谱联用技术快速分析测定牡丹果荚中白藜芦醇含量的方法。

背景技术：

白藜芦醇是多酚类化合物，又称芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。更是具有抗氧化作用、抗自由基作用，抗菌作用，对免疫系统的调节作用，抗衰老作用等。其来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，而本文在牡丹果荚中发现并检测到该物质。

随着对白藜芦醇研究的不断深入，人们发现白藜芦醇还具有调节免疫、抗病毒、抗变态反应、保肝等作用。此外，白藜芦醇可以被用作添加剂加到药品、酒类或化妆品中，作为一种新型美容保健品以延缓人的衰老，保持肌肤水分，祛除疮类、黄褐斑等。

已有文献报道白藜芦醇的检测方法，均采用高效液相色谱紫外检测器法：

[1]黄瑞民,张娟,李凯,谢一民.宁夏干红葡萄酒中反式白藜芦醇的含量测定[j].华中师范大学学报(自然科学版),2018,52(05):673-677.分析时长15分钟。

[2]沈宏桂,李德来.高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇含量的研究[j].现代食品,2018(13):94-96.分析时长20分钟。

[3]向鹏宇,陈健,吕紫璇,陈亚.hplc同时测定桑白皮中绿原酸、东莨菪内酯、白藜芦醇、桑色素4种成分的含量[j].北方药学,2018,15(07):1-2.分析时长25分钟。

[4]徐杰,谢鑫,郑祥清,廖清华,林静葳,戴玉梅.花生芽中白藜芦醇的提取和含量分析[j].广东化工,2018,45(12):62-63.

[5]孙志猛,杨楠,叶晓川.不同产地白蔹中总酚酸以及没食子酸、原儿茶醛、儿茶素和白藜芦醇的含量测定[j].湖北中医药大学学报,2018,20(03):43-46.分析时长40分钟。

[6]杨荣艳,刘琬晖,高楠楠.hplc法测定山葡萄藤中白藜芦醇含量[j].中国卫生产业,2018,15(15):6-8.分析时长60分钟。

[7]张萍,倪红妹,谷东陈.液相色谱检测葡萄酒中白藜芦醇的含量[j].食品工业,2018,39(02):314-316.分析时长20分钟。

[8]刘臣,唐长波.hplc法测定不同产地花生根中白藜芦醇含量[j].现代农业科技,2018(03):247-248+250.分析时长15分钟。

[9]吴艳丽,杨鸿雁,郭君钦.hplc法测定山葡萄藤中白藜芦醇的含量[j].临床医药文献电子杂志,2017,4(38):7499.分析时长20分钟。

[10]冯愈钦,郭红艳,刘贵珊,何建国,王松磊,贺晓光.宁夏葡萄酒中白藜芦醇含量的高效液相色谱快速测定[j].食品研究与开发,2017,38(05):156-161.分析时长30分钟。

[11]张红玉,王成章,原姣姣,张昌伟,王志宏.牡丹籽壳中白藜芦醇的分离及结构表征[j].中国油脂,2017,42(02):116-119.分析时长50分钟。

[12]甄玉改.反相hplc法测定比格犬血浆中白藜芦醇含量及其药代动力学研究[j].实用医药杂志,2017,34(01):52-54.分析时长15分钟。

[13]鲍慧玮,侯晓琳,刘芳馨,张晨,刘佳.hplc法测定不同产地爬山虎茎中白藜芦醇的含量[j].中国民族民间医药,2016,25(21):17-19.分析时长50分钟。

[14]郑先波,申炎龙,史江莉,谭彬,叶霞,李继东,万欣珠,冯建灿,翟德华,王腾飞.中国野生葡萄果皮和叶片白藜芦醇含量测定[j].果树学报,2016,33(09):1092-1102.分析时长15分钟。

[15]徐硕,梁晓丽,金鹏飞,邝咏梅,姜文清,吴学军.高效液相色谱法测定保健品中白藜芦醇的含量[j].中南药学,2015,13(11):1210-1212.分析时长10分钟。

[16]徐菁,李志浩,李鹏.高效液相色谱法测定痹痛酊中白藜芦醇的含量[j].湖北中医药大学学报,2015,17(05):54-56.分析时长15分钟。

[17]黄德福.hplc法同时测定肝甦颗粒中白藜芦醇和绿原酸的含量[j].中国现代药物应用,2015,9(18):275-277.分析时长25分钟。

[18]侯建波,谢文,史颖珠,沈炜锋,何建敏.高效液相色谱法测定进口葡萄酒中的白藜芦醇及其甙[j].理化检验(化学分册),2015,51(07):938-942.分析时长20分钟。

[19]沈齐英,贾丹.高效液相色谱测定葡萄酒中白藜芦醇含量[j].北京石油化工学院学报,2014,22(04):1-3.分析时长10分钟。

[20]黄强.高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇的含量[j].民营科技,2013(11):93.分析时长10分钟。

[21]刘庆,曹福成,孙英鸿.高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇的含量[j].生命科学仪器,2013,11(z1):9-11.

[22]张奇,于凉云.高效液相色谱法测定葡萄酒和葡萄干中白藜芦醇的含量[j].化工时刊,2008,22(12):39-40+77.分析时长10分钟。

[23]舒友琴,陈敏,何计国,戴蕴青,冯力更.固相萃取-高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷异构体[j].色谱,2005(01):88-91.分析时长20分钟。

[24]孙狄,章震兴,王轶男,时卫萍.高效液相色谱法测定红葡萄酒中白藜芦醇的四种异构体[j].色谱,2004(04):424-427.分析时长30分钟。

[25]马丽艳,李景明.葡萄酒中顺反式白藜芦醇异构体的反相高效液相色谱法测定[j].分析测试学报,2004(06):87-90.分析时长30分钟。

[26]薛洁.山葡萄酒中白藜芦醇含量的测定[j].酿酒科技,2004(05):103-104.分析时长30分钟。

从已检索的文献中采用高效液相色谱紫外检测器法，灵敏度远不及本发明采用的三重四极杆质谱检测器，并且其提取过程复杂繁琐，检测时间相对本发明提供方法较长，本发明采用的三重四极杆质谱检测器很好的解决了上述问题，5分钟内完成测试，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。而且无相关报道检测牡丹果荚中白藜芦醇。

本发明与中国专利zl201610319728x快速测定肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷活性成分的方法相比较，梯度洗脱程序不同，所用流动相不同，质谱参数设置也不同(离子源温度不同，鞘气压力也不同)。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种快速测定牡丹果荚中白藜芦醇活性成分含量的方法，该方法采用超高效液相色谱-质谱联用技术对牡丹果荚中白藜芦醇活性成分含量进行定量测定，经方法学考察试验，确认本方法，分析速度快，5分钟内完成测试，灵敏度高、重现性好，是测定牡丹果荚中白藜芦醇含量的快速有效手段。

本发明所述的一种快速测定牡丹果荚中白藜芦醇活性成分含量的方法，该方法采用超高效液相色谱-质谱条件，具体操作按下列步骤进行：

a、超高效液相色谱条件：色谱柱：hypersilgold,c18100×2.1mm，1.9μm；流动相：a-水，b-甲醇；洗脱梯度：0-1分钟，a70％；1-2分钟，a70％-20％；2.0-4.0分钟a20％；4.0-4.1分钟a20％-70％；4.1-5.0分钟a70％，流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样量：5μl；

b、三重四极杆质谱条件：离子源电压：-3000v；离子源温度：350℃；鞘气：30arb；辅助气：8arb；离子传输毛细管温度：350℃；离子源类型：电喷雾离子源，白藜芦醇保留时间2.95分钟，母离子m/z226.983，特征碎片离子为定量离子182.823和142.604；

c、样品溶液制备：精密称取风干样品粉末1.0000g，加入体积比为30:70的水-无水乙醇溶液，20ml，微波消解提取，温度60℃，时间2分钟；

d、对照品溶液的制备：精密称取1.00mg对照品，用甲醇溶解定容至1ml，作为对照品溶液储备液；

e、标准曲线绘制：精密移取白藜芦醇对照品溶液储备液，并用稀释剂体积比30:70的水:甲醇分别稀释成浓度为2ng/ml，4ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，200ng/ml，得到标准溶液；按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得其组分标准曲线，计算回归方程；

f、含量测定：精密吸取样品待测液，按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分析，并将峰面积带入标准曲线，计算白藜芦醇的含量；

g、精密度试验：连续进样8针，测得峰面积rsd，相对保留时间rsd；

h、重复性试验：取样品粉末约1g，共7份，精密称定，按步骤c样品溶液的制备项提取并分析；

i、稳定性试验：取步骤h中同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样，测定其中白藜芦醇的含量，并计算rsd值。

附图说明

图1为本发明标样的谱图；

图2为本发明实例样品中的谱图。

具体实施方式

实施例

本发明用本地种植的牡丹为例，样品采回后按本发明提供的测定方法进行果荚中白藜芦醇的含量测定：

仪器与试剂：

超高效液相色谱仪(agilent1290)；质谱仪(thermotsqquantumultra)；全自动微波消解萃取仪(mars6cemc)；万分之一电子天平(mettleram100)；甲醇为色谱纯试剂，白藜芦醇对照品(sigma)；

仪器条件：

超高效液相色谱仪条件：

色谱柱：hypersilgold，c18100×2.1mm，1.9μm；流动相：a-超纯水，b-甲醇；洗脱梯度：

流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样量：5μl；

三重四极杆质谱仪条件：离子源电压：-3000v；离子源温度：350℃；鞘气：30arb；辅助气：8arb；离子传输毛细管温度：350℃；离子源类型：esi；

对照品溶液的制备：精密称取1.00mg对照品，用甲醇溶解定容至1ml，作为对照品溶液储备液；

样品溶液的制备：自然风干，去除牡丹籽，果荚磨成粉末，精密称取1.0000g，加入20ml浸提液为体积比70:30的无水乙醇:超纯水，微波消解温度60℃，时间2分钟；

标准曲线绘制：精密移取白藜芦醇对照品溶液储备液，并用稀释剂为体积比30:70的水:甲醇分别稀释成浓度为2ng/ml，4ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，200ng/ml，得到标准溶液；按色谱条件进行超高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得各组分标准曲线，计算回归方程，白藜芦醇y＝-238.629+148.804*x，r²＝0.9991，n＝6；

含量测定：精密吸取样品待测液上液相色谱仪检测，测得白藜芦醇的峰面积，经标准曲线，计算得出该样品的白藜芦醇含量为183.577-625.482ng/g；

精密度试验：连续进样8针，测得峰面积rsd1.56％，相对保留时间rsd0.12％；

重复性试验：取样品粉末1g，共7份，精密称定，按步骤样品溶液的制备提取并分析，结果为：白藜芦醇(ng/g)：241.37,250.18,245.774,248.662,243.382,244.325,245.658,rsd1.23％；

稳定性试验：取步骤重复性试验同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8h进样，测定其中白藜芦醇的含量，并计算rsd值为0.67％。