一种全二维气相色谱-飞行时间质谱联用定性阿魏胶挥发油的方法与流程

本发明涉及一种分析测试组分的方法，具体涉及一种全二维气相色谱-飞行时间质谱联用定性阿魏胶挥发油的方法。

背景技术：

阿魏属(ferula.l)隶属于伞形科前胡族，约有150余种，主要分布于地中海、中亚及其邻近地区。用于治疗心腹冷痛、腹部肿块、慢性肠胃炎、虫积、慢性支气管炎及风湿性关节炎等症，具有消积、杀虫、祛湿、止痛的功效。近代科学研究证明，阿魏油胶油脂中，化学成分十分丰富，很多具有生理活性，从主要类别上可以分为聚硫烷类、萜烯类、醇类、酯类、酸类、酮类和醛类等成分。如何全面的将这些成分进行定性，有利于阿魏药材的全面和有效利用，对寻找阿魏的药用资源，扩大阿魏药源具有重要意义。

近年来，随着仪器分析设备的不断更新，检测分析水平的不断提高，阿魏挥发油组分的检测由气相色谱、液相色谱仪发展到气质联用，组分的种类由几十种发展到上百种。1997年6(2):26-31植物资源与环境杂志中刘启新等学者采用hp5988型气相色谱质谱联用仪分析了不同产地阿魏挥发油成分，16种阿魏挥发油共分离出325种挥发油成分，其中鉴定出214种，不同产地阿魏挥发油成分差异显著。2001年中成药23(1):54-57中倪慧等学者用dan13800型气相色谱仪和vg7070e型质谱仪对阿魏根挥发油进行检测，共分离出62个成分，用质谱法鉴定出其中34个化合物。在2003年新疆医科大学学报26(3):283谭秀芳等分别用溶剂浸取法和水蒸气蒸馏技术得到挥发油样品，采用turbomass-autosystemxl型气相色谱质谱联用仪分析，经与质谱数据库和标准图对照结合人工解析，共鉴定出33种化台物，两者成分完全一致。在2004年中国民族民间医药杂志68:173-174上戴斌等对香阿魏的化学成分进行分析。利用qp2010型气相色谱-质谱联用仪从提取的挥发油中分离出50个组分，鉴定了其中36种成分。2005年光谱实验室杂志22(4):763-766宋东伟等利用turbomass-autosystemxl型气相色谱质谱联用分析仪对超临界二氧化碳萃取的阿魏根样挥发油进行定性分析，得到31个物质峰，积分29个，鉴定出15个；水蒸气蒸馏提取得21个峰，鉴定出15个。在2007年质谱学报28(2):114-121中邓卫萍等采用水蒸气蒸馏法从新疆阿魏中提取挥发油成分，用气相色谱-质谱法对新疆阿魏的挥发性成分进行了分离鉴定，分离出38种成分，共确认了其中36种成分。在安徽农业科学杂志2009年37(22):10500-10522中赵文彬等用美国菲尼根公司生产的trace型气相色谱质谱联用仪分离出大果阿魏叶挥发油中84个成分，鉴定出其中的78种化合物；树脂胶挥发油分离出77个成分，鉴定出63种化合物。在2013年中成药杂志35(6):1251-1256中雷林洁等用安捷伦7890a-5975c型气质联用仪，采用面积归一化法计算出各组分的相对百分含有量，经数据库检索，在多伞阿魏挥发油中鉴定出44种化合物。2013年中成药杂志35(11):2442-2448中盛萍等学者分别采用水蒸气蒸馏法、溶剂回流提取法、超声提取法、微波萃取法、微波一超声协助萃取法、渗漉提取法和超临界萃取法制备多伞阿魏挥发油，用气相色谱-质谱联用法分析其化学成分，从7种不同方法制备的多伞阿魏挥发油中分别鉴定出41、30、28、30、36、31、31个化合物，共鉴定了74个化合物。2014年中成药杂志36(7):1551-1553上郭亭亭等通过安捷伦7890a-5975cgc-ms气质联用质谱仪测定了新疆阿魏及其炮制品的挥发油。新疆阿魏原药材挥发油中鉴别出35种成分，从民间习用炮制品、清炒炮制品、醋炙炮制品、水煮炮制品分别鉴别出34种、34种、32种、35种成分。在中国现代应用药学杂志2015年32(1):30-36盛萍采用水蒸气蒸馏法提取8个产地44份多伞阿魏挥发油，通过安捷伦7890a-5975c型气相色谱质谱仪分析其成分，44份多伞阿魏挥发油气相色谱中平均鉴定了45.1个成分。在2017年中国野生植物资源杂志36(2):20-23阿依别克·热合木都拉等学者利用沃特世2695型高效液相色谱仪测定了阿魏不同部位挥发油中阿魏酸含量。

由于复杂体系分离分析的需要，多维联用技术成为近年来国际上研究的热点。其中全二维气相色谱(gc×gc)及其与飞行时间质谱(tofms)联用即是新近发展起来的一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定技术。与普通的二维技术不同，全二维气相色谱是把分离原理不同而又互相独立的两根不同极性的色谱柱以串联方式连接。调制器在连接中起到重要作用，其对分离的物质起捕集、聚焦、再传送的作用。经第一根色谱柱分离后的每一个色谱峰，都经调制器调制后再以脉冲方式送到第二根色谱柱进一步分离。所谓全二维色谱，意义就在于此。第一根色谱柱后流出的峰经数次捕集、聚焦、再传送过程进入第二根色谱柱快速分离，经由检测器检测得到原始数据文件。原始的数据文件根据所用的调制周期和检测器的采集频率进行转换得到二维矩阵数据。在矩阵谱图中，不同调制周期的第二维谱图按周期数并肩排列。可视化是通过颜色、阴影或等高线图的方式将峰在二维平面上呈现出来，有时也用三维图形描述。在三维色谱图中，x轴表示的是第一维柱的保留时间，y轴表示的是第二维柱的保留时间，z轴表示的是色谱峰的强度。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种全二维气相色谱-飞行时间质谱联用定性阿魏胶挥发油的方法，该方法采用两支极性不同的色谱柱对挥发油中组分进行正交分离，并在调制器的作用下进入飞行时间质谱完成检测，本发明测定挥发油所用到的分析设备具有高通量、高灵敏度和高准确度的特点，与传统的气相色谱质谱联用法相比，具有峰容量更大、分辨率更高、灵敏度更好、定性更有规律等优点。克服现有阿魏挥发油检出成分较少的不足。

本发明所述的一种全二维气相色谱-飞行时间质谱联用定性阿魏胶挥发油的方法，按下列步骤进行：

a、取干燥的阿魏胶，粉碎，过4-6目筛，将阿魏胶置于圆底烧瓶，加入300ml蒸馏水，浸泡过夜，水蒸气蒸馏5h，停止加热，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水，即得供试品溶液，储存于温度-4℃冰箱备用；

b、用移液枪吸取挥发油50μl，用乙酸乙酯定容至1ml，自动进样器进样1μl，经进样口进入，经全二维气相色谱-飞行时间质谱分析；

全二维气相色谱的分析条件：

c、色谱柱采取gc×gc柱系统，一维色谱柱为：rxi-5silms型色谱柱，30m×0.25mm内径，膜厚0.25μm；二维色谱柱为：rxi-17silms型二级色谱柱，1.79m×0.18mm内径，膜厚0.18μm；

色谱条件：气相色谱进样口温度260-280℃，进样模式采用分流模式进行，分流比25:1；

d、第一维柱温箱升温程序：起始温度35-45℃，保持4-6min后，以1-3℃/min升温至170-190℃，保持0.5-2min，再以5-7℃/min升温至260-280℃，保持0.5-2min，调制器调制时间为6-10s，热调制时间为0.6-1s，冷调制时间2.4-4s，调制补偿温度为10-20℃；

e、第二维柱温箱升温程序：起始温度50-60℃，保持4-6min，以1-3℃/min升温至190-200℃，保持0.5-2min，再以5-7℃/min升温至280-290℃，保持0.5-2min，样品运行采用恒流模式，载气为纯度>99.9995％高纯氦气，流速为0.9-1.1ml/min；

飞行时间质谱的分析条件为：

f、电子轰击离子源，电压为70ev，离子源温度为220-240℃，传输线温度为190-210℃，检测器电压为1300-1400v，采集质量数范围为40-500amu，采集频率为100-110图谱/秒，溶剂延迟3-5min，数据采集由pegasus4d仪器工作站软件控制；

数据处理条件为：

g、实验采集的飞行时间质谱数据由仪器pegasus工作站数据处理系统进行处理，自动识别信噪比大于100的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库比对，质谱库为mainlab和replib，相似度大于700，所有比对结果自动生成峰表，再将峰表经过进一步人工解谱及同系物二维色谱出峰规律比对验证后作为初步鉴定结果，选择相似度大于800，反向相似度大于800的化合物作为最终鉴定结果。

本发明所述的一种全二维气相色谱-飞行时间质谱联用定性阿魏胶挥发油的方法，该方法的优点及积极效果：通过水蒸气蒸馏法获得的挥发油采用全二维气相色谱-飞行时间质谱进行定性分析，比传统的气相色谱-质谱法具有更大的峰容量，更高的灵敏度，获得的挥发油信息更全面。传统的气相色谱-质谱法只有一根色谱柱，非极性或极性，而全二维气相色谱-飞行时间质谱采用gc×gc双柱系统，物质可以根据分子大小和极性大小先后分离，获得更加全面的分离信息。因此，本方法可以用于多组分、较复杂样品的分析，对于阿魏胶挥发油的分析具有较好的优势。

附图说明

图1为本发明实例样品阿魏胶挥发油的全二维气相色谱-飞行时间质谱总离子流图；

图2为本发明实例样品阿魏胶挥发油的全二维气相色谱-飞行时间质谱二维表面图；

图3为本发明实例样品阿魏胶挥发油的全二维气相色谱-飞行时间质谱三维轮廓图。

具体实施方式

下面结合附图、主要成分表及具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

仪器：美国力可pegasus4d型全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(gc×gc-tofms)；配备安捷伦7890b全二维气相色谱仪，安捷伦g4567a自动进样器，挥发油提取器；500ml圆底烧瓶；调温电热套，型号dztw；

试剂：乙酸乙酯，色谱纯；无水硫酸钠，分析纯；二次蒸馏水；

取干燥的阿魏胶，经粉碎机粉碎，过4-6目的筛，称取15g阿魏胶置于圆底烧瓶中，加入300ml蒸馏水，浸泡过夜，水蒸气蒸馏5h，停止加热后，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水，即得供试品溶液，储存于温度-4℃冰箱备用；

用移液枪吸取挥发油50μl，乙酸乙酯定容至1ml，自动进样器进样1μl，经进样口进入，经全二维气相色谱-飞行时间质谱分析，综合分析结果得到阿魏胶挥发油组分结果；

仪器条件：

色谱柱采取gc×gc柱系统，一维色谱柱rxi-5silms型色谱柱(crossbond技术键合4-双(二甲基硅氧烷基)亚苯基二甲基聚硅氧烷)，30m×0.25mm内径，膜厚0.25μm，非极性色谱柱；二维色谱柱rxi-17silms型二级色谱柱(crossbond技术键合50％二苯基/50％二甲基聚硅氧烷)，1.79m×0.18mm内径，膜厚0.18μm，中等极性色谱柱，两根色谱柱以柱接头连接器以串联方式连接，气相色谱进样口温度270℃，进样模式采用分流模式进行，分流比25:1；

第一维柱温箱升温程序：起始温度40℃保持5min后，以2℃/min升温至180℃保持1min，再以6℃/min升温至270℃保持1min；

调制器调制时间为8s，热调制时间为0.8s，冷调制时间3.2s，调制补偿温度为15℃；

第二维柱温箱升温程序：起始温度55℃保持5min，后以2℃/min升温至195℃保持1min，再以6℃/min升温至285℃保持1min；

样品运行采用恒流模式，载气为高纯氦气(纯度>99.9995％)，流速为1ml/min；

飞行时间质谱的分析条件为：电子轰击离子源，电压为70ev，离子源温度为230℃，传输线温度为200℃，检测器电压为1380v，采集质量数范围为40-500amu，采集频率为100图谱/秒，溶剂延迟4min；

实验采集的飞行时间质谱数据由仪器pegasus工作站数据处理系统进行处理，自动识别信噪比大于100的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库比对，质谱库为mainlab和replib，相似度大于700，所有比对结果自动生成峰表，峰表经过进一步人工解谱及同系物二维色谱出峰规律比对验证后作为初步鉴定结果；利用本发明方法在阿魏胶挥发油中共检测出1675个组分，选择相似度大于800，反向相似度大于800的化合物作为最终鉴定结果，共有485个组分，具体结果见表1(表中仅列出百分含量相对较高的297种)；

表1阿魏胶挥发油的主要成分表

从表中可以看出：通过本发明所述方法定性出百分含量相对较高的297个组分的百分含量占总峰的77.87％，其中主要成分为单萜类及倍半萜类衍生物，其中单萜及其衍生物占22.21，倍半萜及其衍生物占23.90％，单萜类及倍半萜类衍生物多具有消炎抗菌及解痉镇痛作用，这与民间用药经验基本相符。另外，通过本发明还定性出其他烯类6.06％，酮类6.32％，酸类3.48％，以及酯类和烷类等。本发明所述方法比传统的气相色谱-质谱法具有更大的峰容量，更高的灵敏度，获得的挥发油信息更全面。本发明所述方法适用于阿魏胶挥发油组分的定性分析。