一种用质谱仪检测人类血液中LBP含量的试剂盒的制作方法

本发明属于试剂盒技术领域，尤其涉及一种用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒。

背景技术：

脂多糖(1ipopolysaccharide，lps)又称内毒素，是革兰阴性细菌外膜的主要成分。lps与急性期蛋白脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein，lbp)结合，可导致炎症反应失控及免疫防御屏障机能下降，引起全身炎性反应综合征、脓毒性休克、急性肺损伤甚至多器官功能障碍综合征。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein,lbp)是一种分子量为60kda,456个氨基酸组成的糖蛋白，以单链多肽的形式在肝细胞内合成，它属于i型急性期反应蛋白，存在于人和动物的血清中。lbp既可将细菌脂多糖(lipopolysaccharide,lps)多聚体转换为单聚体,加速lps与其受体cd14结合,显著放大lps的致炎作用；也可加速lps与靶细胞膜上的清除受体结合,使lps被靶细胞清除；还可催化lps与脂蛋白结合,后者可中和lps的生物学活性,加速体内lps的清除。然而，现有用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒不能检测lbp基因标签单核甘酸多态性位点，功能单一；同时，现有血清或血浆样本粘稠度都较高，采用单纯采用人阴性血清或血浆、小牛血清进行稀释，受检测时间限制，往往难以稀释混合均匀，导致检测结果容易存在一定的偏差。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒不能检测lbp基因标签单核甘酸多态性位点，功能单一；同时，现有血清或血浆样本粘稠度都较高，采用单纯采用人阴性血清或血浆、小牛血清进行稀释，受检测时间限制，往往难以稀释混合均匀，导致检测结果容易存在一定的偏差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒。

本发明是这样实现的，一种用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒包括：

30倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂a、显色剂b、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪；

终止液为hcl和h2so4；

显色剂a由：pbs缓冲液，柠檬酸，ed-ta乙二氨四乙酸，proclin-300，过氧化氢(过氧化氢挥发性太高，容易丢失，我们现在正用过氧化脲来代替，效果还不错)组成；

显色剂b由：pbs缓冲液，柠檬酸，ed-ta乙二氨四乙酸，proclin-300，硫代硫酸钠等。

一种用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒检测方法如下：

步骤一，标准品加入标准品稀释液进行稀释；

步骤二，加样；

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

步骤三，用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

步骤四，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

步骤五，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

步骤六，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；重复步骤三和步骤五操作；

步骤七，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

步骤八，每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

步骤九，利用高效液相串联质谱仪对上述液体进行检测，得到血液中lbp色谱图，计算人类血液中lbp含量数据。

进一步，所述lbp基因标签单核甘酸多态性位点的检测方法如下：

1)特异性引物的设计

根据被证实的lbp基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；

2)pcr扩增

以待测标本的dna为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行pcr反应，得pcr扩增物；

3)焦磷酸测序

将步骤2)所得pcr扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链pcr扩增产物纯化后，与步骤1)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的靶单核甘酸是否具备多态性。

进一步，所述标准品稀释液包括：缓冲溶液、白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/l、碱金属氯化物、任选的乳化剂；并且所述稀释液的ph值为6.0～8.0。

进一步，所述白蛋白选自：血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白。

进一步，所述缓冲溶液选自：磷酸缓冲溶液(pb)、磷酸盐缓冲溶液(pbs)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(tris-hcl)或其组合。

进一步，所述稀释液还包括选自下组的一种或多种组分：

(a)金属离子螯合物；

(b)碱金属硫酸盐；

(c)防腐剂。

进一步，所述稀释液具有以下的一种或多种特性：

(a)所述稀释液在室温下的电导率ρ为0.55×10⁴～0.75×10⁴μs/cm；

(b)所述稀释液为待测样本提供的渗透压为250～380mosm/kg；

(c)所述稀释液的ph为7.2～7.8。

本发明的优点及积极效果为：本发明通过采用高特异性引物和适宜方法的组合，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测lbp基因标签snp基因型，可用于lbp基因在疾病遗传易感性的关联研究，能够满足临床检验实际工作的需要，利于lbp基因标签snp检测预测疾病的发生、发展风险。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短dna序列分析，便于构建标准化操作流程，具有高精准、高通量、低成本等优点；pcr扩增引物效率高，产物可直接进行焦磷酸测序，无需进行产物纯化等二次处理，操作简便，样品用量少；同时，提供的稀释液检测结果精确可靠，分散效果良好，可长期稳定保存，并且可通用于不同的临床免疫诊断项目的血清或血浆样本稀释液，对于临床医学诊断具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒结构框图。

图2是本发明实施例提供的用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒检测方法流程图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒包括：30倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂a、显色剂b、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪；

终止液为hcl和h2so4；

显色剂a由：pbs缓冲液，柠檬酸，ed-ta乙二氨四乙酸，proclin-300，过氧化氢(过氧化氢挥发性太高，容易丢失，我们现在正用过氧化脲来代替，效果还不错)组成；

显色剂b由：pbs缓冲液，柠檬酸，ed-ta乙二氨四乙酸，proclin-300，硫代硫酸钠等。

如图2所示，一种用质谱仪检测人类血液中lbp含量的试剂盒检测方法如下：

步骤s101，标准品加入标准品稀释液进行稀释；

步骤s102，加样；

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

步骤s103，用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

步骤s104，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

步骤s105，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

步骤s106，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；重复步骤三和步骤五操作；

步骤s107，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

步骤s108，每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

步骤s109，利用高效液相串联质谱仪对上述液体进行检测，得到血液中lbp色谱图，计算人类血液中lbp含量数据。

本发明提供的lbp基因标签单核甘酸多态性位点的检测方法如下：

1)特异性引物的设计

根据被证实的lbp基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；

2)pcr扩增

以待测标本的dna为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行pcr反应，得pcr扩增物；

3)焦磷酸测序

将步骤2)所得pcr扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链pcr扩增产物纯化后，与步骤1)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的靶单核甘酸是否具备多态性。

本发明提供的标准品稀释液包括：缓冲溶液、白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/l、碱金属氯化物、任选的乳化剂；并且所述稀释液的ph值为6.0～8.0。

本发明提供的白蛋白选自：血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白。

本发明提供的缓冲溶液选自：磷酸缓冲溶液(pb)、磷酸盐缓冲溶液(pbs)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(tris-hcl)或其组合。

本发明提供的稀释液还包括选自下组的一种或多种组分：

(a)金属离子螯合物；

(b)碱金属硫酸盐；

(c)防腐剂。

本发明提供的稀释液具有以下的一种或多种特性：

(a)所述稀释液在室温下的电导率ρ为0.55×10⁴～0.75×10⁴μs/cm；

(b)所述稀释液为待测样本提供的渗透压为250～380mosm/kg；

(c)所述稀释液的ph为7.2～7.8。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。