基于表面等离子体共振技术的四环素检测方法与流程

本发明涉及分子检测技术领域，具体地，涉及一种基于表面等离子体共振技术的四环素检测方法。

背景技术：

四环素类抗生素在畜牧业和临床治疗方面被广泛应用，人类长期摄入含四环素类抗生素残留的食品后，会对健康构成潜在危害。四环素类抗生素在环境中的残留主要表现在土壤环境、水环境、肉类、乳制品、鸡蛋等食品中，其检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、荧光分光光度法、hplc法等。由于食品样品基质复杂，目标物含量较低，测定前必须采取有效的样品前处理。目前四环素类抗生素残留的检测方法主要有高效液相色谱、色谱/质谱联用技术、酶联免疫分析等，其中色谱分析法仪器设备贵重，样品前处理复杂，需专业人员操作；而酶联免疫分析方法相对复杂，灵敏度较低，成本较高，且均需要复杂的样品前处理。与上述检测方法相比，表面等离子共振传感(surfaceplasmonresonance，spr)技术，是一种基于物质折射率变化的实时、无标记的现代分析技术，具有样品无需标记且用量少、操作简单、检测灵敏度高、实时监测反应动态、芯片可重复使用等优点。

四环素残留分析是对复杂基质中痕量组分的检测，采用适当的提纯方法是建立准确、快速、高灵敏四环素残留检测的关键所在。目前，磁性纳米粒子(mnps)由于具有制备方法简单、价廉易得、低毒，在外加磁场下具有可控运动等优点，已被广泛用作制备分子印迹聚合物的磁性载体。磁性分子印迹聚合物(mmips)是以磁性材料为载体，具有特定分子识别位点的聚合物。fe3o4纳米粒子(fe3o4nps)由于其制备简单，成本低廉，常作为分子印迹聚合物的载体，在外加磁场的作用下，该聚合物可直接选择性的富集分离待测物，故可有效的解决食品样品前处理耗时长、分离难等问题，将其与分析方法相结合应用于检测，可实现对待测物快速、准确、高灵敏的检测。

表面等离子体共振(spr)技术是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的交界面上，发生全内反射，入射光的渐消失波与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学spr技术测定时，一般是将spr传感芯片进行修饰，当加入待测样品并使其与传感芯片表面的修饰物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起spr光学信号的改变。由于spr技术的高灵敏性、快速、便捷等优点，已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选，食品环境检测等领域。

目前，国内外未见将对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子(mmipsnps)与spr检测技术相结合的研究与报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种基于表面等离子体共振技术的四环素检测方法，该方法将对四环素具有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子(mmipsnps)与spr技术相结合，不仅提高了检测的灵敏度和准确性，且检测快速、操作简单、选择性高、重现性和再生性好，回收率符合要求，具有重要的实际应用价值。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于表面等离子体共振技术的四环素检测方法，包括如下步骤：

(1)将mmipsnps加入到待测样品溶液中，经震荡、静置后，利用外加磁场分离得到四环素mmipsnps；

(2)将所述四环素mmipsnps利用缓冲液定容至所述待测样品溶液的初始体积后，将其直接注入经巯基乙胺修饰的spr芯片表面，测得所述待测样品溶液中的四环素含量。

优选地，所述震荡包括：将待测样品溶液进行漩涡震荡30-50min；所述静置的时间为5-10min。

优选地，在所述定容前，所述四环素mmipsnps利用所述缓冲液清洗2-5次。

优选地，所述经巯基乙胺修饰的spr芯片通过包括以下步骤的方法制得：

(1)对spr芯片进行预处理；

(2)将经所述预处理后的spr芯片安装在spr传感器上，通入缓冲液，待基线平稳后，再通入巯基乙胺溶液，使该巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得。

优选地，所述缓冲液的流速为8-15μl/min，所述巯基乙胺溶液的浓度为0.5-3.5mg/ml、流速为8-15μl/min、体积为100-150μl。

优选地，所述预处理包括：将spr芯片在无水乙醇中浸泡3-8min，经水冲洗5-8次后用氮气吹干，用氢火焰灼烧15-30s后冷却。

优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的ph优选为7.2-7.4。

优选地，所述mmipsnps通过包括以下步骤的方法制得：

(i)将六水合氯化铁溶于水后，通氮除氧并进行搅拌，加入四水合氯化亚铁、氢氧化钠溶液和柠檬酸，在温度为75-95℃、转速为500-600r/min条件下反应1-2h；

(ii)将步骤(1)制得的溶液冷却至室温，用磁铁进行分离后收集产物a，用水洗涤所述产物a至ph为6-7，真空干燥，制得表面羧基化fe3o4纳米粒子(fe3o4@canps)；

(iii)将四环素、甲基丙烯酸加入乙醇-水溶液中，搅拌20-40min，得到预组装溶液；将步骤(2)制得的表面羧基化fe3o4纳米粒子和二甲基丙烯酸乙二醇酯加入所述预组装溶液中，超声处理20-40min获得预聚合溶液；将所述预聚合溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮-乙醇溶液中，再加入偶氮二异丁腈，通入氮气保护，在温度为50-70℃、转速为250-350r/min条件下反应20-30h；利用磁铁富集分离收集产物b，将所述产物b用甲醇-乙酸溶液洗涤6-8次，再用水洗涤2-3次，真空干燥，制得对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子，即mmipsnps。

优选地，所述步骤(i)中六水合氯化铁、四水合氯化亚铁、氢氧化钠和柠檬酸的质量比为(4.5-5.5)：(1.5-2.5)：(3-3.5)：1，所述六水合氯化铁与所述水的质量与体积比为(4.5-5.5)：100g/ml。

优选地，所述步骤(iii)中所述乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为1：7-10，所述甲醇-乙酸溶液中甲醇与乙酸的体积比为4-9：1；所述四环素、甲基丙烯酸、表面羧基化fe3o4纳米粒子、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙烯吡咯烷酮和偶氮二异丁腈的质量比为(4-5)：(2-9)：(2.5-10)：(37-42)：(3.5-4.5)：1。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用mmipsnps兼具磁性快速分离和分子特异性识别的特点，有效简化了前处理的步骤，减少背景干扰且缩短了检测时间。同时，由于mmipsnps本身具有折射率大的特性，有效地提高了spr的响应信号，使得新构建的spr传感器具有高灵敏度，检测限为0.98pg/ml。

(2)本发明利用mmipsnps与四环素发生特异性结合，经外加磁场分离后得到的结合物直接进行spr检测，将样品前处理技术与检测技术相结合，有效提高了检测的灵敏度和准确度，且操作简单，检测速度快。此外该spr传感器具有良好的特异性、重现性和回收率，可直接对动物源性食品中四环素的残留进行检测，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1是本发明中mmipsnps增强spr传感器的响应信号，a四环素浓度为0pg/ml时的mmipsnps，b四环素浓度为50pg/ml时的mmipsnps，c表示四环素浓度为50pg/ml时的mnipsnps，d表示四环素浓度为1000pg/ml时的mmipsnps；

图2是本发明中spr传感器对四环素检测的特异性；

图3是本发明中spr传感器实时检测四环素的动力学曲线，a四环素浓度为5pg/ml，b四环素浓度为7.5pg/ml，c四环素浓度为10pg/ml，d四环素浓度为25pg/ml，e四环素浓度为50pg/ml，f四环素浓度为100pg/ml。

图4是本发明中spr传感器检测四环素的工作曲线。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供一种基于表面等离子体共振技术的四环素检测方法，包括如下步骤：

(1)将mmipsnps加入到待测样品溶液中，经震荡、静置后，利用外加磁场分离得到四环素mmipsnps；

(2)将所述四环素mmipsnps利用缓冲液定容至所述待测样品溶液的初始体积后，将其直接注入经巯基乙胺修饰的spr芯片表面，测得所述待测样品溶液中的四环素含量。

优选地，所述震荡包括：将待测样品溶液进行漩涡震荡30-50min；所述静置的时间为5-10min。

优选地，在所述定容前，所述四环素mmipsnps利用所述缓冲液清洗2-5次。

优选地，所述经巯基乙胺修饰的spr芯片通过包括以下步骤的方法制得：

(1)对spr芯片进行预处理；

(2)将经所述预处理后的spr芯片安装在spr传感器上，通入缓冲液，待基线平稳后，再通入巯基乙胺溶液，使该巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得。

优选地，所述缓冲液的流速为8-15μl/min，所述巯基乙胺溶液的浓度为0.5-3.5mg/ml、流速为8-15μl/min、体积为100-150μl。

优选地，所述预处理包括：将spr芯片在无水乙醇中浸泡3-8min，经水冲洗5-8次后用氮气吹干，用氢火焰灼烧15-30s后冷却。

优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)，所述pbs缓冲液的ph优选为7.2-7.4。

优选地，所述mmipsnps通过包括以下步骤的方法制得：

(i)将六水合氯化铁溶于水后，通氮除氧并进行搅拌，加入四水合氯化亚铁、氢氧化钠溶液和柠檬酸，在温度为75-95℃、转速为500-600r/min条件下反应1-2h；

(ii)将步骤(1)制得的溶液冷却至室温，用磁铁进行分离后收集产物a，用水洗涤所述产物a至ph为6-7，真空干燥，制得表面羧基化fe3o4纳米粒子(fe3o4@canps)；

(iii)将四环素、甲基丙烯酸加入乙醇-水溶液中，搅拌20-40min，得到预组装溶液；将步骤(2)制得的表面羧基化fe3o4纳米粒子和二甲基丙烯酸乙二醇酯加入所述预组装溶液中，超声处理20-40min获得预聚合溶液；将所述预聚合溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮-乙醇溶液中，再加入偶氮二异丁腈，通入氮气保护，在温度为50-70℃、转速为250-350r/min条件下反应20-30h；利用磁铁富集分离收集产物b，将所述产物b用甲醇-乙酸溶液洗涤6-8次，再用水洗涤2-3次，真空干燥，制得对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子，即mmipsnps。

采用同样的制备方法，不添加四环素的条件下，合成磁性非分子印迹纳米粒子(mnipsnps)。

本发明中，所述水可以为超纯水、蒸馏水、去离子水或其他任意一种实验用水。

优选地，所述步骤(i)中六水合氯化铁、四水合氯化亚铁、氢氧化钠和柠檬酸的质量比为(4.5-5.5)：(1.5-2.5)：(3-3.5)：1，所述六水合氯化铁与所述水的质量与体积比为(4.5-5.5)：100g/ml。

优选地，所述步骤(iii)中所述乙醇-水溶液中乙醇与水的体积比为1：7-10，所述甲醇-乙酸溶液中甲醇与乙酸的体积比为4-9：1；所述四环素、甲基丙烯酸、表面羧基化fe3o4纳米粒子、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚乙烯吡咯烷酮和偶氮二异丁腈的质量比为(4-5)：(2-9)：(2.5-10)：(37-42)：(3.5-4.5)：1。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，所采用的spr芯片为美国biosensinginstrument公司生产的，所使用的spr仪器为美国biosensinginstrument公司生产的bi-spr2000；巯基乙胺购于美国sigma-aldrich公司；四环素购于上海瑞永生物科技有限公司；甲基丙烯酸购于上海麦克林生化科技有限公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯购于上海阿拉丁生化科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮购于国药集团化学试剂有限公司；偶氮二异丁腈购于上海山浦化工有限公司；金霉素购于上海源叶生物科技有限公司；磺胺嘧啶购于上海瑞永生物科技有限公司；诺氟沙星购于上海源叶生物科技有限公司；其他试剂及牛奶样品均为市售品。

制备例1

(1)将4.5g六水合氯化铁溶于100ml超纯水后，通氮除氧并进行搅拌；加入1.5g四水合氯化亚铁、37.5ml浓度为2mol/l氢氧化钠溶液和1g柠檬酸，在温度为75℃、转速为500r/min条件下反应1h；

(2)将步骤(1)制得的溶液冷却至室温，用磁铁进行分离后收集产物a，用超纯水反复洗涤至中性，超声3次，真空干燥，制得表面羧基化fe3o4纳米粒子(fe3o4@canps)；

(3)将0.4g四环素、0.35g甲基丙烯酸加入10ml乙醇-水溶液溶液中(v水：v乙醇＝7:1)，搅拌20min，得到预组装溶液；取0.25g步骤(2)制得的表面羧基化fe3o4纳米粒子和3.7g二甲基丙烯酸乙二醇酯加入所述预组装溶液中，超声处理20min获得预聚合溶液；将所述预聚合溶液加入到含有0.35g聚乙烯吡咯烷酮的100ml乙醇溶液中，再加入0.1g偶氮二异丁腈，在氮气保护下，在温度为50℃、转速为250r/min条件下反应20h；利用磁铁富集分离收集产物b，将所述产物b用甲醇-乙酸溶液(v甲醇：v乙酸＝7:1)洗涤6次，再用超纯水洗涤2次，真空干燥，即得对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子(mmipsnps)。

采用同样的制备方法，不添加四环素的条件下，合成磁性非分子印迹纳米粒子(mnipsnps)。

制备例2

(1)将5g六水合氯化铁溶于100ml超纯水后，通氮除氧并进行搅拌；加入2g四水合氯化亚铁、40ml浓度为2mol/l氢氧化钠溶液和1g柠檬酸，在温度为85℃、转速为550r/min条件下反应1.5h；

(2)将步骤(1)制得的溶液冷却至室温，用磁铁进行分离后收集产物a，用超纯水反复洗涤至中性，超声4次，真空干燥，制得表面羧基化fe3o4纳米粒子(fe3o4@canps)；

(3)将0.45g四环素、0.65g甲基丙烯酸加入10ml乙醇-水溶液中(v水：v乙醇＝9:1)，搅拌30min，得到预组装溶液；取0.5g步骤(2)制得的表面羧基化fe3o4纳米粒子和3.9g二甲基丙烯酸乙二醇酯加入所述预组装溶液中，超声处理30min获得预聚合溶液；将所述预聚合溶液加入到含有0.4g聚乙烯吡咯烷酮的100ml乙醇溶液中，再加入0.1g偶氮二异丁腈，在氮气保护下，在温度为60℃、转速为300r/min条件下反应24h；利用磁铁富集分离收集产物b，将所述产物b用甲醇-乙酸溶液(v甲醇：v乙酸＝4:1)洗涤7次，再用超纯水洗涤3次，真空干燥，即得对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子(mmipsnps)。

制备例3

(1)将5.5g六水合氯化铁溶于100ml蒸馏水后，通氮除氧并进行搅拌；加入2.5g四水合氯化亚铁、44ml浓度为2mol/l氢氧化钠溶液和1g柠檬酸，在温度为95℃、转速为600r/min条件下反应2h；

(2)将步骤(1)制得的溶液冷却至室温，用磁铁进行分离后收集产物a，用蒸馏水反复洗涤至中性，超声5次，真空干燥，制得表面羧基化fe3o4纳米粒子(fe3o4@canps)；

(3)将0.5g四环素、0.85g甲基丙烯酸加入10ml乙醇-水溶液中(v水：v乙醇＝10:1)，搅拌40min，得到预组装溶液；取0.75g步骤(2)制得的表面羧基化fe3o4纳米粒子和4.2g二甲基丙烯酸乙二醇酯加入所述预组装溶液中，超声处理40min获得预聚合溶液；将所述预聚合溶液加入到含有0.45g聚乙烯吡咯烷酮的100ml乙醇溶液中，再加入0.1g偶氮二异丁腈，通氮气，在温度为70℃、转速为350r/min条件下反应30h；利用磁铁富集分离收集产物b，将所述产物b用甲醇-乙酸溶液(v甲醇：v乙酸＝9：1)洗涤8次，再用蒸馏水洗涤2次，真空干燥，即得对四环素有特异性吸附的磁性分子印迹纳米粒子(mmipsnps)。

采用同样的制备方法，不添加四环素的条件下，合成磁性非分子印迹纳米粒子(mnipsnps)。

实施例1

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡5min，经水冲洗3次后，用氮气吹干，再用氢火焰灼烧20s；

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以10μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.4)，待基线平稳后，以10μl/min的流速通入100μl浓度为3.5mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片；

(3)分别配制浓度为50pg/ml和1000pg/ml的四环素-pbs缓冲液溶液；

(4)将5mg制备例1制得的mmipsnps加入到1ml最终浓度分别为0pg/ml、50pg/ml和1000pg/ml的四环素溶液中形成样品a、b、d，将5mg制备例1制得的mnips加入到1ml浓度为50pg/ml的四环素溶液中形成样品c。将上述样品溶液分别漩涡震荡40min，静置5min后经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用pbs缓冲液反复洗涤3次，再用pbs缓冲液定容至1ml；

(5)将步骤(4)所得的溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测(每个样品进行三次平行检测)。每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测。图1中纵坐标△θ(mdeg)代表的是共振角度的变化值(即spr信号的变化值)，共振角度的变化值(△θ)＝样品流经芯片后达到稳定的共振角度减去样品进入仪器之前的稳定的共振角度。

如图1所示，无四环素(0pg/ml)溶液中加入mmipsnps后(样品a)，共振角度的变化值仅为1.10mdeg，这可能是由于非特异性吸附引起的；当利用mmipsnps富集四环素后进行spr传感器检测，spr共振角度的变化值非常显著，并且随着四环素浓度的增加而增加(b：四环素浓度50pg/ml，△θ为19.39mdeg；d：四环素浓度1000pg/ml，△θ为46.21mdeg)。此外，相同浓度的四环素溶液(50pg/ml)，分别利用mmipsnps和mnipsnps富集分离后，进行spr检测引起的共振角度变化值分别是19.39mdeg和4.47mdeg，mmipsnps的spr共振角度变化值是mnipsnps的4.34倍，这说明本发明所建立的方法具有良好的特异性。

实施例2

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡3min，经水冲洗8次后，氮气吹干后，再用氢火焰灼烧15s；

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以8μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.2)，待基线平稳后，以8μl/min的流速通入150μl浓度为0.5mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片；

(3)配制四环素、金霉素、磺胺嘧啶和诺氟沙星的最终浓度均为50pg/ml的混合溶液a，四环素和金霉素最终浓度均为50pg/ml的混合溶液b，四环素和磺胺嘧啶最终浓度均为50pg/ml的混合溶液c，四环素和诺氟沙星最终浓度均为50pg/ml的混合溶液d，四环素最终浓度为50pg/ml的溶液e、金霉素最终浓度为50pg/ml的溶液f、磺胺嘧啶最终浓度为50pg/ml的溶液g和诺氟沙星最终浓度为50pg/ml的溶液h，分别用mmipsnps和mnipsnps对溶液a-h进行富集分离：将5mg制备例3制得的mmipsnps加入1ml溶液a-h中，将5mg制备例3制得的mnipsnps加入1ml溶液a-h中。将上述样品溶液，分别漩涡震荡30min，静置7min后经外加磁场分离后得到结合物，将结合物用pbs缓冲液反复洗涤2次，再用pbs缓冲液定容至1ml；

(4)将步骤(3)所得的溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测。每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测。每个样品进行三次平行检测，验证该检测方法的特异性。

如图2所示，各种样品经mmipsnps和mnipsnps富集分离后，直接进行spr传感器检测，mmipsnps引起的共振角度变化值(△θ)均明显高于mnipsnps引起的共振角度变化值(△θ)；其次，含有四环素的样品中加入mmipsnps引起的共振角度变化值(△θ)也明显高于不含有四环素的样品中加入mmipsnps引起的共振角度变化值(△θ)，这说明四环素mmipsnps耦合spr传感器对四环素检测具有良好的特异性。从单一成分的样品溶液(e、f、g、h)看出，经mmipsnps富集四环素后引起的共振角度变化值为19.39mdeg，是mmipsnps富集磺胺嘧啶后引起的共振角度变化值的5.71倍、mmipsnps富集诺氟沙星后引起的共振角度变化值的4.32倍，但仅仅是mmipsnps富集金霉素后引起的共振角度变化值的1.15倍，这是由于四环素和金霉素都属于四环素类化合物，结构极其相似，故其响应信号也相对较高。

实施例3

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡8min，经水反复冲洗，氮气吹干后，再用氢火焰灼烧30s；

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以15μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.4)，待基线平稳后，以15μl/min的流速通入120μl浓度为2.5mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片；

(3)称取5mg制备例3制得的mmipsnps，将其加入1ml不同浓度的四环素-pbs缓冲液溶液中，获得四环素的最终浓度分别为0pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、7.5pg/ml、10pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、75pg/ml、100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml的样品，漩涡震荡50min，静置10min后经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用pbs缓冲液(10mm、ph7.4)反复洗涤5次，再用pbs缓冲液定容至1ml。

(4)将步骤(3)所得的样品溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测，每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测，每个浓度的四环素溶液进行三次平行检测，记录spr响应信号，绘制spr动力学曲线和工作曲线(s/n＝3)，结果如图3和图4所示，四环素最终浓度为5pg/ml的样品溶液与巯基乙胺在200s左右开始结合、500s左右开始解离、700s时基本达到结合-解离的动态平衡；四环素最终浓度为100pg/ml的样品溶液与巯基乙胺在200s左右开始结合、515s时开始解离、700s时基本达到结合-解离的动态平衡。根据图3可以明显看出，四环素最终浓度为100pg/ml的样品溶液在spr芯片表面达到结合-解离的动态平衡时，其spr信号(共振角度)远远高于5pg/ml的四环素mmipsnps达平衡时的spr信号(共振角度)，在四环素最终浓度为5-100pg/ml范围内，四环素的浓度与spr信号成线性关系，线性回归方程为y＝0.33031x+2.80487(r²＝0.99549)，最低可检测浓度为5pg/ml，最低检测限为0.98pg/ml。

实施例4

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡5min，经水反复冲洗，氮气吹干后，再用氢火焰灼烧15s，

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以12μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.4)，待基线平稳后，以12μl/min的流速通入150μl浓度为2mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片。

(3)牛奶样品的前处理：准确称取5g牛奶样品a，置于50ml比色管中，用0.1mol/ledta-mcllvaine缓冲溶液溶解并定容至50ml，漩涡混合1min，冰水浴超声10min，转移至50ml聚丙烯离心管中，冷却至0-4℃，在转速5000r/min条件下离心10min，上清液过0.22μm的滤膜。

(4)取步骤(3)制得的样品溶液，分别采用本发明方法、国标(gbt21317-2007)和elisa方法进行检测，结果均未检出四环素，说明本发明中所建检测方法具有良好的准确性。

(5)取步骤(3)制得的样品溶液，经添加四环素标准品，将5mg制备例2制得的mmipsnps加入到1ml四环素-牛奶溶液中，使样品溶液中四环素最终加标浓度分别为10pg/ml、25pg/ml、50pg/ml，漩涡震荡40min，静置6min后经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用pbs缓冲液(10mm、ph7.4)反复洗涤3次，再用pbs缓冲液定容至1ml。

(6)将步骤(5)所得的溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测，每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测，每个浓度的四环素-牛奶溶液进行三次平行检测，记录spr响应信号，考察所发明的方法检测四环素的准确性。

检测结果见表1，牛奶样品a的加标回收率为95.7-104.56％，rsd范围为2.18-13.72％，回收率在允许范围内，符合回收率的要求。

表1牛奶样品a的加标回收率

实施例5

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡5min，经水冲洗3次后，用氮气吹干，再用氢火焰灼烧20s；

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以10μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.4)，待基线平稳后，以10μl/min的流速通入100μl浓度为3.5mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片；

(3)牛奶样品的前处理：准确称取5g牛奶试样b，置于50ml比色管中，用0.1mol/ledta-mcllvaine缓冲溶液溶解并定容至50ml，漩涡混合1min，冰水浴超声10min，转移至50ml聚丙烯离心管中，冷却至0-4℃，在转速5000r/min条件下离心10min，上清液过0.22μm的滤膜。

(4)取步骤(3)制得的样品溶液，分别采用本发明方法、国标(gbt21317-2007)和elisa方法进行检测，结果均未检出四环素，说明本发明中所建检测方法具有良好的准确性。

(5)取步骤(3)制得的样品溶液，经添加四环素标准品，将5mg制备例2制得的mmipsnps加入到1ml四环素-牛奶溶液中，使样品溶液中四环素最终加标浓度分别为10pg/ml、25pg/ml、50pg/ml，漩涡震荡40min，静置6min后经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用pbs缓冲液(10mm、ph7.4)反复洗涤3次，再用pbs缓冲液定容至1ml。

(6)将步骤(5)所得的溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测，每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测，每个浓度的四环素-牛奶溶液进行三次平行检测，记录spr响应信号，考察所发明的方法检测四环素的准确性。

检测结果见表2，牛奶样品b的加标回收率为96.26-105.69％，rsd范围为2.67-6.28％，回收率在允许范围内，符合回收率的要求。

表2牛奶样品b的加标回收率

实施例6

(1)将spr芯片在无水乙醇中浸泡5min，经水冲洗3次后，用氮气吹干，再用氢火焰灼烧20s；

(2)将冷却后的spr芯片安装在spr传感器上，以15μl/min的流速通入pbs缓冲液(10mm、ph7.4)，待基线平稳后，以15μl/min的流速通入100μl浓度为1.5mg/ml的巯基乙胺溶液，使巯基乙胺溶液在spr芯片表面进行自组装制得经巯基乙胺修饰的spr芯片；

(3)牛奶样品的前处理：准确称取5g牛奶试样c，置于50ml比色管中，用0.1mol/ledta-mcllvaine缓冲溶液溶解并定容至50ml，漩涡混合1min，冰水浴超声10min，转移至50ml聚丙烯离心管中，冷却至0-4℃，在转速5000r/min条件下离心10min，上清液过0.22μm的滤膜。

(4)取步骤(3)制得的样品溶液，分别采用本发明方法、国标(gbt21317-2007)和elisa方法进行检测，结果均未检出四环素，说明本发明中所建检测方法具有良好的准确性。

(5)取步骤(3)制得的样品溶液，经添加四环素标准品，将5mg制备例2制得的mmipsnps加入到1ml四环素-牛奶溶液中，使样品溶液中四环素最终加标浓度分别为10pg/ml、25pg/ml、50pg/ml，漩涡震荡40min，静置8min后经外加磁场分离后得到结合物，该结合物用pbs缓冲液(10mm、ph7.4)反复洗涤3次，再用pbs缓冲液定容至1ml。

(6)将步骤(5)所得的溶液以10μl/min的流速，通入步骤(2)制得的经巯基乙胺修饰的spr芯片，使其与巯基乙胺结合固定在传感芯片表面，进行四环素的直接检测，每次样品检测完后用水或naoh(1mm-5mm，具体浓度，视响应信号而定)进行spr芯片的再生，再进行下一次样品检测，每个浓度的四环素-牛奶溶液进行三次平行检测，记录spr响应信号，考察所发明的方法检测四环素的准确性。

检测结果见表3，牛奶样品c的加标回收率为94.79-100.24％，rsd范围为4.58-12.01％，回收率在允许范围内，符合回收率的要求。

表3牛奶样品c的加标回收率

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。