本发明涉及荧光增白剂检测领域，具体涉及一种食品食用菌中荧光增白剂的液质检测方法。
背景技术：
近年来，由于食品包装引发的食品安全问题层出不穷。“塑化剂”风波、毒奶瓶双酚a事件、保鲜膜deha(己二酸二异辛酯)污染、尿素甲醛树脂取代密胺餐具释放有毒物质等，一系列食品包装引发的食品安全问题会对人们的健康造成严重的影响。近期，食品荧光增白剂问题频发，“荧光剂混入爆米花桶事件”、“康师傅、统一方便面杯检出荧光剂”、“上海多家食品企业陷入荧光剂罗生门”、“口蘑中检出荧光剂”，愈发引起人们对食品中荧光增白剂物质的担忧。荧光增白剂(fwas)是一种可作为荧光染料的复杂有机化合物，能吸收波长300～400nm的紫外光并激发出波长420～480nm的蓝色或蓝紫色荧光，与机体物质的黄光互补产生增白效果。
荧光增白剂(fwas)是含有芳香胺基结构和苯乙烯结构的苯环类有机物，它会削弱伤口的愈合能力；同时，荧光增白剂会在体内蓄积，是潜在致癌因素之一，国家严禁在食品及食品相关产品加工中使用荧光增白剂。通过食品包装引入食品的荧光增白剂一方面是由于生产企业对包装材料使用不当，一方面是违规添加禁用助剂造成。通用级的聚苯乙烯树脂每吨在1.2万元左右，食品级每吨在1.4万元，外购废塑料每吨在5000—8000元之间，与之相似，食品级的纸包装材料要求使用100％原木浆生产，出于成本考虑促使一些不法商人非法使用工业滑石粉、回收废料用于生产食品包装材料，带来有毒物质安全隐患。目前，国内外关于荧光增白剂(fwas)的检测方法主要有紫外分光光度法、荧光光光度法、高效液相色谱法。紫外分光光度法和荧光光光度法适用于产品中一定含量的荧光增白剂定性检测，不能用于鉴别种类和定量检测，也不适于食品中的微量检测，且受人为因素和设备的影响较大；对于组成复杂的样品，测定结果的准确性难以保证，不适用于监督执法部门的相关执法检测。而液相色谱法只能依靠化合物的保留时间定性，易受杂质干扰。
国内目前在食品方面，尚未建立相应的食品中荧光增白剂检测方法，也未见对食品中荧光增白剂物质污染情况及本底情况的研究报道，这与近年来频发的荧光增白剂事件不相符合，也不能反应食品中荧光增白剂的风险情况，无法缓解人们对食品中荧光增白剂现状的担忧和满足迫切的知情要求。
技术实现要素：
本发明提供一种食品食用菌中荧光增白剂的液质检测方法，该方法通过萃取、吸附净化一体化方法和浓缩方法对食品样品进行预处理，采用超高效液相色谱-串联质谱检测食品样品中fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa393等10种荧光增白剂，用于解决国内在有关荧光增白剂食品安全问题上缺乏有效检测方法的问题。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
一种食品食用菌中荧光增白剂的液质检测方法，用于检测食品食用菌中的10种荧光增白剂：fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa393；该方法具体包括以下步骤：
(1)10种荧光增白剂标准曲线的建立
a1标准储备液配制：分别称取fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa39310种荧光增白剂标准品至不同棕色容量瓶中，加入三氯甲烷溶剂配制成质量浓度为1mg/ml的标准储备液，2～8℃避光保存；
a2混合标准工作液配制：准确吸取适量的fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa393标准储备液于容量瓶中，用乙腈定容，相应配制为荧光增白剂浓度为320ug/ml的混合标准工作液；
a3标准曲线建立：将混合标准工作液注入高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪进行检测，得到10种荧光增白剂的标准曲线；其中，检测条件如下：
色谱条件：色谱柱为phenomenexkinetexc18，其规格为100mm×2.1mm，2.6μm；流动相a为乙腈溶剂；流动相b为甲酸溶液；梯度洗脱程序为：0～1min,10％a；1～10min,10～80％a；10～15min,80～90％a；15～18min,90～10％a；18～20min,10％a；
质谱条件：电喷雾离子源；离子源温度为550℃；正离子扫描；多反应监测模式检测；雾化气流量为50l/h；加热辅助气流量为50l/h；气帘气流量为30l/h；电喷雾电压为5500v；
fwa135的去簇电压为100v，碰撞能量为44ev；
fwa140的去簇电压为140v，碰撞能量为44ev；
fwa162的去簇电压为90v，碰撞能量为53ev；
fwa184的去簇电压为70v，碰撞能量为81ev；
fwa185的去簇电压为70v，碰撞能量为49ev；
fwa199的去簇电压为250v，碰撞能量为35ev；
fwa367的去簇电压为60v，碰撞能量为54ev；
fwa368的去簇电压为135v，碰撞能量为45ev；
fwa378的去簇电压为150v，碰撞能量为30ev；
fwa393的去簇电压为150v，碰撞能量为42ev；
(2)食品样品中10种荧光增白剂的含量测定
b1食品食用菌样品预处理：按照质量比1:1的比例，称取nacl和粉碎后食品样品混匀，得到混合试样；
b2萃取溶剂配制：按照体积比为95～98:5～2的比例，量取乙腈溶液与甲酸溶液混匀，得到萃取溶剂；
b3荧光增白剂的萃取与吸附：称取适量混合试样，按照比例，在每克混合试样中加入2.5～4ml萃取溶剂，旋涡震荡5～10min后离心，将上层清液转移至提前放有600～800mg吸附剂的离心管中，旋涡震荡5～10min后离心，再将上层清液转移至离心管中，于40～45℃平衡定量浓缩仪中浓缩至干；然后在残留物中加入2ml乙腈旋涡溶解，过0.2μm滤膜得到萃取净化后的待检测样品溶液；
b4荧光增白剂的液质检测：将待检测样品溶液注入高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，采用与步骤a3相同的检测条件进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线得到待检测样品溶液中10种荧光增白剂的含量。
优选地，步骤a3中流动相b为质量浓度为0.1％甲酸溶液。
优选地，步骤a3中色谱柱的柱温为40℃。
优选地，步骤a3中流动相a和b的流速为0.5ml/min。
优选地，步骤a3中进样量为12μl。
优选地，步骤b2中，萃取溶剂中甲酸的质量浓度为2％。
优选地，步骤b3中，吸附剂的组分由mgso4、psa和c18构成。
优选地，吸附剂中组分mgso4、psa和c18的质量比为：5:12:50。
优选地，步骤b3中萃取后离心的离心温度为4℃，转速为15000r/min。
优选地，步骤b3中吸附后离心的离心温度为5℃，转速为15000r/min。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.建立液相色谱-质谱联用的液质建检方法，采用保留时间与特征离子对比例对已知目标物进行定型和定量分析，准确性和灵敏性优势明显。
2.本方法对样品的预处理采用的是集萃取、吸附净化、浓缩为一体的前处理方法，该方法和采用固相萃取对样品进行前处理的传统方法相比，能够有效地缩短前处理时间，提高检测效率。
3.采用本方案建立的液相色谱-质谱联用的液质建检方法，在流动相色谱条件下难以被色谱柱基线分离的fwa367和fwa393荧光增白剂，其在质谱条件下能实现有效分离。
4.本方法中采用无水mgso4、psa和c18共同作为吸附剂，用于食品试样的吸附净化处理。无水mgso4颗粒更细，具有理想的脱水效果；同时，离心吸附的过程中，在低温条件下进行，很好地控制无水mgso4吸水放热，放出的热量将萃取液温升至37摄氏度左右，而该温度不会导致10种荧光增白剂的分解，还可以减少样品基质干扰，提高提取效率。
5.本方法对样品进行萃取的过程中，加入了无机盐nacl，既可以改变待测组分的提取效率，同时离心分层更加明显，同时降低了产品的基质效应。
6.本方案建立的液相色谱-质谱联用的液质建检方法，10种荧光增白剂在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.9900，方法检出限在0.08～0.8μg/kg之间，定量低限在0.3～1.4μg/kg之间，方法的平均回收率在78.5～108.3％之间。
7.采用本方案所建立的方法，具有灵敏、快速、简单、准确、实用性强的特点，可以应用于其他食用菌及其他食品中荧光增白剂的检测，为国内食品建立相应的荧光增白剂检测方法提供条件，弥补国内空白。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
以下实施例所用到的仪器、标准品、试剂与材料如下：
仪器：agilent6460型高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪；gx274-全自动固相萃取系统；gpcultra5ml全自动凝胶渗透仪；低温恒温槽；anpelnitrogenevaporator；tgl-16m型冷冻离心机；平行定量浓缩仪、再循环冷却系统b-740、真空泵v-700/701(瑞士buchi公司)；vortexgenie2型涡旋涡旋混合器；dty-b1200(电子天平，福州华志科学仪器有限公司)；聚四氟乙烯ptfe滤膜；
标准品：fwa135(纯度≥94.0％)；fwa140(纯度≥94.0％)；fwa162(纯度≥95.0％)；fwa184(纯度≥98.0％)；fwa185(纯度≥98.0％)；fwa199(纯度≥98.0％)；fwa367(纯度≥98.0％)；fwa368(纯度≥98.0％)；fwa378(纯度≥98.0％)和fwa393(纯度≥98.0％)。以上标准品均购自美国internationallaboratory公司；
试剂：甲醇、乙腈、无水mgso4(色谱纯，德国merck公司)；丙基乙二胺(primarysecondaryamine，psa)、c18(分析纯，粒径40～63μm上海安谱公司)。实验用milli-q超纯水(美国millipore公司)。
材料：鸡腿菇、金针菇、白灵菇、双孢蘑菇均由河南省农科院分析测试中心提供样品。
实施例1
本实施例提供一种食品中食用菌荧光增白剂的液质检测方法，用于检测食品中食用菌的10种荧光增白剂：fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa393；该方法主要10种荧光增白剂标准曲线的建立、以及食品食用菌样品中10种荧光增白剂的含量测定两大工艺过程，其中：
所述10种荧光增白剂标准曲线的建立主要包括以下步骤：
a1标准储备液配制：分别称取50mg的fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa39310种荧光增白剂标准品至不同棕色容量瓶中，加入三氯甲烷溶剂定容至50ml，配制成质量浓度为1mg/ml的标准储备液，2～8℃避光保存；
a2混合标准工作液配制：准确吸取适量的fwa135、fwa140、fwa162、fwa184、fwa185、fwa199、fwa367、fwa368、fwa378和fwa393标准储备液于100ml容量瓶中，用乙腈定容至各荧光增白剂浓度为320ug/ml的混合标准工作液，备用；
a3标准曲线建立：以12μl的进样量，将依次将各混合标准工作液注入高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪进行检测，其检测条件如下：
色谱条件：色谱柱为phenomenexkinetexc18，其规格为100mm×2.1mm，2.6μm；柱温为40℃；流动相a为乙腈溶剂，流动相b为0.1％的甲酸溶液，流动相a和b的流速为0.5ml/min；梯度洗脱程序为：0～1min,10％a；1～10min,10～80％a；10～15min,80～90％a；15～18min,90～10％a；18～20min,10％a；
质谱条件：电喷雾离子源；离子源温度为550℃；正离子扫描；多反应监测模式检测；雾化气流量为50l/h；加热辅助气流量为50l/h；气帘气流量为30l/h；电喷雾电压为5500v；其余的质谱参数见表1。
采用以上方法得到10种荧光增白剂的标准曲线，各荧光增白剂在质量浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.9900，以3倍和10倍信噪比分别计算检出限(lod)和定量限(loq)(以鲜鸡腿菇计)，具体结果见表2。
表1：10种荧光增白剂质量分析参数
表2:10种荧光增白剂的线性回归方程和相关系数
所述食品食用菌样品中10种荧光增白剂的含量测定主要包括以下步骤：
b1食品食用菌样品预处理：按照质量比1:1的比例，分别称取nacl和粉碎后食用菌样品2.0g，混匀，得到混合试样；如果使用的是干的食用菌样品，则在混合试样加入10ml超纯水。
b2萃取溶剂配制：按照体积比为98:2的比例，分别量取9.8ml乙腈溶液和0.2ml质量浓度为2％甲酸，混匀，得到萃取溶剂；
b3荧光增白剂的萃取与吸附：按照比例，在每克混合试样中加入2.5ml萃取溶剂，旋涡震荡5～10min后，在4℃15000r/min离心10min，将上层清液转移至提前放有670mg吸附剂的离心管中，旋涡震荡5～10min后，在5℃15000r/min离心10min，再将上层清液转移至离心管中，于40℃平衡定量浓缩仪中浓缩至干；然后在残留物中加入2ml乙腈旋涡溶解，过0.2μm滤膜得到萃取净化后的待检测样品溶液；其中，吸附剂由mgso4、psa和c18构成，mgso4、psa和c18之间的质量比为5:12:50；
b4荧光增白剂的液质检测：将待检测样品溶液注入高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，采用与步骤a3相同的检测条件进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线得到待检测样品溶液中10种荧光增白剂的含量。
为了进一步检验本方法的准确度和精确度，分别对阴性食用菌样品进行加标回收实验。具体方法为：以乙腈作为溶剂，分别将所述10种荧光增白剂标准品配制成质量浓度为2.0、5.0和15μg/kg的标准品加标液，对原待检测样品溶液进行6次平行加标实验，平均回收率在78.5～108.3％之间，相对标准偏差(rsd)在1.4～6.9％之间，其具体检测结果见表3。
表3：食用菌加标回收率和相对标准偏差
采用本方案所述方法对15批次鸡腿菇、20批次金针菇、20批次白灵菇、18批次双孢蘑菇样品进行检测，紫外灯检测共检出有荧光物质污染的是1批次白灵菇和1批次双孢蘑菇。采用该发明方法检测共检测出白灵菇样品中荧光增白剂fwa393，检出量为11.3μg/kg；2批次双孢蘑菇中荧光增白剂fwa393和fwa185，其检出量分别为7.6μg/kg和7.1μg/kg。
采用本方案所建立的方法，具有灵敏、快速、简单、准确、实用性强的特点，可以应用于其他食用菌及其他食品中荧光增白剂的检测，为国内食品建立相应的荧光增白剂检测方法，对有关荧光增白剂的食品安全问题提供了精确的检测分析手段。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改、替换或变形仍在本发明的保护范围以内。