本发明涉及一种决明子对照提取物及其制备方法和用途，尤其是一种决明子萘并吡喃酮类对照提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
中药质量控制与评价是中药研究领域的重要科学问题。现行的重要质量控制方法主要以单一化学成分为对照品，从定性和定量角度对中药材及复方进行质量控制。这种以单一化学成分表征重要整体质量的模式无法真正控制和评价中药质量，与中医药整体观亦不相符。中药成分的复杂性决定了单一成分或指标成分为对照难以客观评价中药的质量，然而，多指标成分的质量评价模式又受到中药化学对照品分离难度大、单体稳定性差以及实验成本过高等因素的制约。
中药对照提取物是指主要化学成分及含量明确、稳定性好、纯度较高的中药提取物，其各化学成分比例相对固定，指标性成分含量已标定，可以实现同时对多个组分进行定性和定量分析，其价格通常低于多个组分单体对照品的总和。因此，中药对照提取物的物质成本较低，检测程序简化，可大大节约检测成本。
萘并吡喃酮类化合物是决明子药材中的一类含量较高，具有保肝、降血脂等作用的特征性成分；但决明子中萘并吡喃酮类化合物单体对照品十分稀缺，价格昂贵甚至没有供应。周德勇等公开了一种决明子萘并吡喃酮类对照提取物的制备方法(周德勇等，《决明子萘并吡喃酮类对照提取物研究及其在决明子药材质量控制中的应用》，中国中药杂志，第42卷第17期，第3385～3390页，2017年9月)，是将决明子药材醇提物上大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇溶液、50％乙醇溶液洗脱，收集50％洗脱液蒸干后得到半制备组分ⅰ；将半制备组分ⅰ与硅胶以3:5的比例均匀拌样，真空干燥，得到拌样硅胶；将该拌样硅胶与空白硅胶以1:13的比例干法上样，用氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:0.6)洗脱，洗脱完成后将干柱分成20部位，合并第2-7、11-17的硅胶，加甲醇洗脱，蒸干，得到半制备组分ⅱ；将半制备组分ⅱ通过ods柱纯化，以甲醇-乙腈(2:1)混合溶液为a相，以水为b相进行梯度洗脱，洗脱程序为30％a(2倍柱体积)、33％a(1倍柱体积)、36％a(1倍柱体积)、39％a(1倍柱体积)、42％a(1倍柱体积)、45％a(1倍柱体积)，然后通过薄层色谱法检识，合并含有指标成分的洗脱液，干燥，得到决明子萘并吡喃酮类对照提取物。该工艺十分复杂，成本高，单次制样量少，耗时费力，可操作性不强，更不适合大规模生产。另外，该制备工艺主要富集三种萘并吡喃酮类化合物。
因此，需要建立一种工艺简单且适合于大生产的决明子萘并吡喃酮类对照提取物制备方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种决明子对照提取物的制备方法，该方法工艺简单且适合大规模制备。进一步地，本发明提供一种制备方法，其能够制得的决明子对照提取物含有四种萘并吡喃酮类指标成分。
本发明的另一目的在于提供一种决明子对照提取物，其萘并吡喃酮类化合物含量高，且含有四种萘并吡喃酮类指标成分。
本发明的再一目的在于提供所述决明子对照提取物用于控制决明子药材质量的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一方面，本发明提供一种决明子对照提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将决明子醇提物上大孔吸附树脂柱，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂进行梯度洗脱，分别得到第一洗脱液和第二洗脱液，收集所述第二洗脱液，干燥，得到半制备组分ⅰ；
其中，所述第一洗脱剂为15～30vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的2～4倍量；所述第二洗脱剂为40～60vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的4～6倍量；
(2)将所述半制备组分ⅰ与拌样用空白硅胶按照重量比为1:1.8～2.4的比例混合均匀，得到拌样硅胶；
(3)将层析用空白硅胶干法装柱并压实，使径高比为1:14.5～18，再装入所述拌样硅胶，压实，从而得到硅胶色谱柱；然后以第三洗脱剂对所述硅胶色谱柱洗脱；
其中，所述硅胶色谱柱中，半制备组分ⅰ与所述层析用空白硅胶的用量比为1g:24～28ml；所述第三洗脱剂为体积比为6.5:3.5:0.6的氯仿、甲醇和水的溶剂体系；且所述第三洗脱剂的体积为所述硅胶色谱柱体积的1.2～1.4倍量；
(4)将洗脱后的硅胶色谱柱自柱头向底部平均分成18～24份，分别加甲醇洗脱得到甲醇洗脱液，分别检测所述甲醇洗脱液，将含有指标成分的甲醇洗脱液合并，干燥，得到所述决明子对照提取物；
其中，所述指标成分为决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的至少一种。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述决明子醇提物是指决明子药材采用25～40vol％的乙醇水溶液作为溶剂提取得到的提取物；所述大孔吸附树脂柱为ab-8大孔吸附树脂柱，且所述决明子醇提物与所述大孔吸附树脂柱中的大孔吸附树脂的用量比为1g:30～70ml。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，所述半制备组分ⅰ溶解在乙醇水溶液中与所述拌样用空白硅胶混合，且所述乙醇水溶液的浓度为40～60vol％。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(3)中，所述半制备组分ⅰ与层析用空白硅胶的用量比为1g:25～26ml。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(3)中，将层析用空白硅胶干法装柱并压实，使径高比为1:15～15.5。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(3)中，所述第三洗脱剂的体积为所述硅胶色谱柱体积的1.25～1.35倍量。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(4)中，所述甲醇洗脱液的检测通过薄层色谱检识，薄层板为硅胶g板，展开剂为体积比为6.5:3.5:0.6的氯仿、甲醇和水的溶剂体系。
另一方面，本发明提供一种决明子对照提取物，其包括决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c，且所述决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的总含量高于60wt％。
根据本发明的决明子对照提取物，优选地，其包括6～13wt％的决明子苷b2、6～13wt％的决明子苷c2、11～35wt％的红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及18～35wt％的决明子苷c。
再一方面，本发明还提供所述决明子对照提取物用于控制决明子药材质量的用途。
本发明的决明子对照提取物的制备方法工艺相对简单，成本更低，稳定可靠，重现性好，适合大规模生产。本发明的决明子对照提取物包含决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c这四种结构明确且含量确切的萘并吡喃酮类成分，纯度较高，含量稳定，可以实现同时对上述四个组分进行定性和定量分析，且成本远低于上述四个组分单体对照品的总和。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
＜制备方法＞
本发明的决明子对照提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)将决明子醇提物上大孔吸附树脂柱，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂进行梯度洗脱，分别得到第一洗脱液和第二洗脱液，收集所述第二洗脱液，干燥，得到半制备组分ⅰ；
其中，所述第一洗脱剂为15～30vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的2～4倍量；所述第二洗脱剂为40～60vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的4～6倍量；
(2)将所述半制备组分ⅰ与拌样用空白硅胶按照重量比为1:1.8～2.4的比例混合均匀，得到拌样硅胶；
(3)将层析用空白硅胶干法装柱并压实，使径高比为1:14.5～18，再装入所述拌样硅胶，压实，从而得到硅胶色谱柱；然后以第三洗脱剂对所述硅胶色谱柱洗脱；
其中，所述硅胶色谱柱中，半制备组分ⅰ与所述层析用空白硅胶的用量比为1g:24～28ml；所述第三洗脱剂为体积比为6.5:3.5:0.6的氯仿、甲醇和水的溶剂体系；且所述第三洗脱剂的体积为所述硅胶色谱柱体积的1.2～1.4倍量；
(4)将洗脱后的硅胶色谱柱自柱头向底部平均分成18～24份，分别加甲醇洗脱得到甲醇洗脱液，分别检测所述甲醇洗脱液，将含有指标成分的甲醇洗脱液合并，干燥，得到所述决明子对照提取物；
其中，所述指标成分为决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的至少一种。
根据本发明的制备方法，步骤(1)中，所述决明子醇提物是指决明子药材采用乙醇水溶液作为溶剂提取得到的提取物。所述乙醇水溶液的浓度可以为25～40vol％，优选为28～35vol％，更优选为30vol％。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述决明子醇提物的制备方法为：将决明子药材用30vol％的乙醇水溶液作为溶剂加热回流提取3次，每次溶剂用量为决明子药材的10倍量，每次提取时间为2h，得到醇提液；将所述醇提液回收溶剂，干燥，得到所述决明子醇提物。
根据本发明的制备方法，步骤(1)中，所述决明子醇提物与所述大孔吸附树脂柱中的大孔吸附树脂的用量比为1g:30～70ml，优选为1g:40～60ml，更优选为1g:50ml。所述决明子醇提物可以用水分散得到上样液，然后上大孔吸附树脂柱。所述上样液中决明子醇提物的含量可以为0.01～0.1g/ml，优选为0.02～0.08g/ml，更优选为0.05g/ml。所述大孔吸附树脂柱优选为ab-8大孔吸附树脂柱。所述大孔吸附树脂柱的径高比可以为1:6～10，优选为1:7～9，更优选为1:8。
根据本发明的制备方法，步骤(1)中，所述第一洗脱剂优选为15～25vol％乙醇水溶液，更优选为20vol％乙醇水溶液。所述第一洗脱剂的用量优选为所述大孔吸附树脂柱体积的2.5～3.5倍量，更优选为3倍量。所述第二洗脱剂优选为45～55vol％乙醇水溶液，更优选为50vol％乙醇水溶液。所述第二洗脱剂的用量优选为所述大孔吸附树脂柱体积的4.5～5.5倍量，更优选为5倍量。
根据本发明的制备方法，步骤(2)中，所述半制备组分ⅰ与拌样用空白硅胶按照重量比优选为1:1.9～2.2，更优选为1:2。所述半制备组分ⅰ可以溶解在少量乙醇水溶液中后与所述拌样用空白硅胶混合，从而有利于得到混合均匀的拌样硅胶。所述乙醇水溶液可以为40～60vol％乙醇水溶液，优选为45～55vol％乙醇水溶液，更优选为50vol％乙醇水溶液。
根据本发明的制备方法，步骤(3)中，所述硅胶色谱柱中，所述半制备组分ⅰ与层析用空白硅胶的用量比为1g:24～28ml，优选为1g:25～26ml。步骤(3)中，将层析用空白硅胶干法装柱并压实，使径高比为1:14.5～18，优选为1:14.5～17，更优选为1:15。所述径高比过大时，柱头的萘并吡喃酮类化合物，特别是决明子苷b2、决明子苷c2的残留率过大；所述径高比过小时，柱头的萘并吡喃酮类化合物，特别是决明子苷b2、决明子苷c2的残留率虽然降低，但是所需的硅胶使用量增大，制备成本提升。采用本发明的上述半制备组分ⅰ的上样量及径高比时，萘并吡喃酮类化合物在柱头残留率小，且所需的硅胶量适中，在确保萘并吡喃酮类成分含量稳定的基础上，降低制备成本。
根据本发明的制备方法，步骤(3)中，优选地，所述第三洗脱剂的体积为所述硅胶色谱柱体积的1.25～1.35倍量，更优选为1.3倍量。
本发明中，所述拌样用空白硅胶和层析用空白硅胶可以是同一种类的空白硅胶，只是为了便于理解将其表述为拌样用空白硅胶和层析用空白硅胶。该空白硅胶的粒径可以在150～350目，优选为200～300目。
根据本发明的制备方法，步骤(4)中，优选地，将洗脱后的硅胶色谱柱自柱头向底部平均分成19～22份，更优选为20～21份。步骤(4)中，所述甲醇洗脱至无色，得到甲醇洗脱液。所述甲醇洗脱液的检测可以通过薄层色谱检识，或者通过高效液相色谱检识，优选通过薄层色谱检识。所述薄层色谱检识采用的薄层板可以为硅胶g板，展开剂可以采用体积比为6.5:3.5:0.6的氯仿、甲醇和水的溶剂体系。该展开剂体系能够将决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c四种萘并吡喃酮类成分充分展开且相邻组分的分离度良好。
本发明的制备方法通过对拌样硅胶中半制备组分ⅰ与空白硅胶的配比、硅胶色谱柱中半制备组分ⅰ与空白硅胶的用量比以及第三洗脱剂的洗脱体积等参数的精确调节，可以在不进行ods柱复杂纯化的情况下获得萘并吡喃酮类成分纯度较高的决明子对照提取物，且该决明子对照提取物中含有决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c四种萘并吡喃酮类成分，更有利于决明子药材的质量控制。本发明的制备方法工艺相对简单，物料成本和时间成本更低，稳定可靠，重现性好，适合大规模生产。
＜决明子对照提取物＞
本发明的决明子对照提取物中含有萘并吡喃酮类成分的含量高于60wt％，优选高于62wt％。决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c，这四种萘并吡喃酮类成分的含量在决明子原料药材和对照提取物中相关性较强，当所用的决明子药材原料中这些指标成分的含量较高时，采用本发明方法制备所得的对照提取物中这些指标成分的含量相对也较高。
根据本发明的决明子对照提取物，优选地，其包括6～13wt％的决明子苷b2、6～13wt％的决明子苷c2、11～35wt％的红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及18～35wt％的决明子苷c。
本发明的对照提取物是根据上述制备方法制备得到的。
相对于现有技术，本发明的决明子对照提取物包含四种结构明确且含量确切的萘并吡喃酮类成分，纯度较高，指标成分含量稳定，可以实现同时对四个组分进行定性和定量分析，且成本远低于上述多个指标成分单体对照品的总和。
＜决明子对照提取物的用途＞
本发明还提供所述决明子对照提取物用于控制决明子药材质量的用途。本发明的决明子对照提取物可用于检测决明子药材的质量。所述用途包括以决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c含量已知的决明子对照提取物为对照，对决明子药材中决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的含量进行测定。
所述决明子对照提取物可以预先以决明子苷b2对照品、决明子苷c2对照品、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷对照品及决明子苷c对照品为对照进行标定，以确定所述决明子对照提取物中决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的含量。可以同时对多个批次的决明子对照提取物进行标定。
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明。
制备例1
将决明子药材用30vol％的乙醇水溶液作为溶剂加热回流提取3次，每次溶剂用量为决明子药材的10倍量，每次提取时间为2h，得到醇提液；将所述醇提液回收溶剂，干燥，得到决明子醇提物。将该决明子醇提物加水分散至0.05g/ml，得到上样液。
将ab-8大孔吸附树脂装柱，得到径高比为1:8的ab-8大孔吸附树脂柱。
实施例1
采用如下方法制备决明子对照提取物：
(1)将制备例1的上样液上制备例1的ab-8大孔吸附树脂柱，使决明子醇提物与ab-8大孔吸附树脂的用量比为1g:50ml，依次用第一洗脱剂和第二洗脱剂进行梯度洗脱，分别得到第一洗脱液和第二洗脱液，收集所述第二洗脱液，干燥，得到半制备组分ⅰ；其中，所述第一洗脱剂为20vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的3倍量；所述第二洗脱剂为50vol％乙醇水溶液，用量为所述大孔吸附树脂柱体积的5倍量；
(2)将半制备组分ⅰ溶解在少量50vol％乙醇水溶液中，然后与拌样用空白硅胶混合均匀，其中半制备组分ⅰ与所述拌样用空白硅胶的重量比为1:2，得到拌样硅胶；
(3)将层析用空白硅胶干法装柱并压实，使径高比为1:15，再装入所述拌样硅胶，压实，从而得到硅胶色谱柱；然后以第三洗脱剂对所述硅胶色谱柱洗脱；
其中，所述硅胶色谱柱中，半制备组分ⅰ与所述层析用空白硅胶的用量比为1g:26ml；所述第三洗脱剂为体积比为6.5:3.5:0.6的氯仿、甲醇和水的溶剂体系；且所述第三洗脱剂的体积为所述硅胶色谱柱体积的1.3倍量；
(4)将洗脱后的硅胶色谱柱自柱头向底部平均分成20份硅胶，分别加甲醇洗脱得到甲醇洗脱液，分别检测所述甲醇洗脱液，将含有指标成分的甲醇洗脱液合并，干燥，得到所述决明子对照提取物。该指标成分包括决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷和/或决明子苷c。
实施例2
取实施例1同一批次的决明子药材，除了步骤(3)中层析用空白硅胶干法装柱并压实，柱直径不变，使径高比为1:17，其他与实施例1相同，得到决明子对照提取物。
对比例1
取实施例1同一批次的决明子药材，除了步骤(3)中层析用空白硅胶干法装柱并压实，柱直径不变，使径高比为1:13，其他与实施例1相同，得到决明子对照提取物。
实验例1
将实施例1～2、对比例1的柱头硅胶用甲醇洗脱，蒸干，干燥，得到柱头浸膏粉末。分别检测实施例1～2、对比例1的决明子对照提取物中决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的含量，以及实施例1～2、对比例1的柱头浸膏粉末中决明子苷b2、决明子苷c2的残留率。柱头浸膏粉末中成分的残留率＝柱头浸膏粉末中成分的量/上样液中成分的总量。实验结果见表1。
表1
当色谱柱径高比为1:13时，柱头中决明子苷b2、决明子苷c2的残留率过大；当色谱柱径高比为1:15和1:17时，柱头中决明子苷b2、决明子苷c2的残留率降低，萘并吡喃酮类成分的总含量提高。其中，色谱柱径高比为1:17时，柱头中决明子苷b2、决明子苷c2的残留率比径高比为1:15略有降低，但是下降幅度较小，而硅胶使用量明显增大，因而整体上看径高比为1:15更适合工业生产。
实验例2
另取决明子药材，采用与实施例1相同的制备工艺分别制备3批决明子对照提取物样品。精密称取各样品12mg，置于50ml量瓶中，加30％甲醇超声溶解，定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，精密吸取10μl进样，高效液相色谱法进行含量测定，结果见表2。
表2
由表2结果可见，不同样品间含量基本稳定，制备方法稳定可靠。
实验例3
另取来自不同产地、批次的s1～s10的决明子药材，采用实施例1相同的制备工艺分别制备10批决明子对照提取物样品，按药材计算对照提取物得率。高效液相色谱法进行含量测定结果见表3。
表3
表3的实验结果表明，以不同批次的决明子药材为原料制备的对照提取物有明显差异，但对照提取物的4个指标成分总含量均达到60wt％以上，说明此制备工艺稳定可行，可用于不同产地、批次药材进行决明子对照提取物的制备工作。
实验例4
取s5的决明子药材34kg，按照实施例1的制备工艺制备决明子对照提取物，得到对照提取物508.95g，其中决明子苷b2、决明子苷c2、红镰霉素-6-o-β-d-龙胆二糖苷及决明子苷c的含量分别为10.81wt％、11.14wt％、20.33wt％、28.29wt％，总含量为70.57wt％。结果表明本发明的工艺可用于大批量制备生产，且工艺稳定。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。