一种碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法与流程

本发明涉及碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料及其制备方法，以及碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法及其装置。

背景技术：

植物激素是植物体内自身合成的一系列痕量有机小分子化合物，对高温、强光、氧气敏感，在含量极低下便可以引发生理反应，其生理效应非常复杂、多样。鉴于植物激素对植物的每个生理过程起着至关重要的调节作用，如何准确、快速分析植物激素在各器官及其细胞水平中含量，成为时代话题，尤其是活体原位分析领域。植物激素的提取溶剂大都采用80％冷甲醇(meoh)，也有一些人采用甲醇/水/甲酸、丙酮/水/乙酸、乙腈等。在提取过程中因水解作用，酶活性的变化和化学衍生作用而使植物激素含量的测定出现假象。植物激素萃取净化方法主要包括液液萃取，固相萃取，基质分散固相萃取，分散液液微萃取等。现有的样品萃取净化方式主要问题在于传统柱试剂用量大，净化不完全，步骤繁琐；不同类别样品和不同类别激素需要不同类型柱子，无法实现自动化和多类多激素的同时分析。固相微萃取技术集采样萃取分离浓缩为一体，易与gc和lc相连，降低原样品的污染和分析物的部分损失，为实时检测植物激素，提供新思路。但该技术应用于植物样品分析中，有萃取纤维头易受污染，涂层容易脱落，价格也比较昂贵，富集率低下，低浓度激素难以检测等缺点。碳纤维被广泛应用于吸附有机污染物的研究中，但碳纤维比表面积小，萃取效率低下，难以实现痕量植物激素的在线全分析。因此，大家把关注点放在了新型涂层材料制备或者新的萃取模式开发。

技术实现要素：

本发明制备了碳纳米纤维/碳纤维，提供了一种浸提微富集实时检测植物激素的色谱分析方法。通过将碳纳米纤维修饰在碳纤维上，形成空间立体三维结构，有效地增加活性位点，进而提高富集率，解决浓度低难以实现实时检测的难题。

本发明提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将碳纤维除浆：除去碳纤维表面的上胶剂，然后放在烘箱中35-50℃干燥15-30min，之后放入干燥器中储存；

(2)从干燥器中取出除浆之后的纯碳纤维(cfs)，用甲醇和水进行淋洗去除表面杂质。然后放在烘箱中35-50℃干燥下15-30min；

(3)碳纤维表面的酸性处理：将干燥后的碳纤维在常温常压下用体积比为1:3硝酸/硫酸溶液酸处理12-15h,使碳纤维表面富含羧基。酸化碳纤维(cfs-h)，用超纯水反复浸提，直至表面中性后，放在烘箱中干燥；

(4)催化剂在碳纤维表面上的沉积：将酸化碳纤维浸渍于已配好的催化剂溶液(正硅酸乙酯：表面活性剂(p123，pluronicp123,eo20po70eo20,mav＝5800)：h2o：乙醇：盐酸：硝酸镍＝1:0.0103:9.36:21.4:0.04:0.47)中48h；

(5)将已浸渍催化剂的碳纤维刷开后抽滤，用催化剂淋洗碳纤维，再抽滤。反复操作，直至碳纤维表面均匀的附着催化剂溶液；

(6)将第(5)步得到的碳纤维放在炉里在420-470℃煅烧20-60min；

(7)化学气相沉积法制备碳纳米纤维/碳纤维(cnfs/cfs复合纤维)：将催化剂均匀涂层于cfs-h表面的碳纤维放置于炉中，以2～20℃/min升温速率通入150-300cc/min流量的惰性气体(氮气、氩气或氦气)，并升温至500-700℃，然后通入10～50cc/min的h2，20-40min，还原催化剂，之后通入碳源乙炔20-40min(10～60cc/min),化学气相沉积反应结束之后，关闭h2和乙炔，升温至700-900℃，通入100～200cc/min的co2气体30～120min，进行表面氧化处理，关闭co2气体，降温至室温。

本发明还提供了由上述制备方法制备的碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法，该方法包括以下步骤：

(1)首先取一束长5-7cm修饰后的碳纳米纤维/碳纤维，依次用甲醇和超纯水淋洗。用超纯水将碳纳米纤维/碳纤维润湿，使碳纳米纤维/碳纤维聚成一簇。然后取4.5-5.5cm的ptfe管(内径为0.6-0.75mm)，清洗过程与清洗碳纳米纤维/碳纤维的过程相同；

(2)将碳纳米纤维/碳纤维其中一端用聚丙烯腈pan进行固定，使碳纳米纤维/碳纤维一端由分散聚成尖端针形，确保其更容易装入聚四氟乙烯ptfe管，然后将碳纤维缓慢地装入ptfe管；

(3)将制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入装有甲醇,乙腈或超纯水的试管中保存，避免碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱接触空气，吸附空气中的杂质，将试管冷藏保存，需要时拿出；

(4)将商品化的固相微萃取装置进行改进，商品化的固相微萃取装置前端焊接一个纵向伸缩弹簧，弹簧一段为针型，确保其更容易进入植物样品内；

(5)制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱相当于萃取头，将其装入改进的带纵向弹簧的固相微萃取装置中。制备好的固相微萃取装置如图4中所示；

(6)实验时，将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，装入改进的商品化固相微萃取装置中。

碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置，该装置包括碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱，该微萃取柱装入前端带有纵向伸缩弹簧的固相微萃取装置中，其中所述碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱由上述的碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料制备，所述碳纳米纤维/碳纤维的一端用pan进行固定，使碳纳米纤维/碳纤维一端由分散聚成尖端针形，装入ptfe管。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取方法，该方法包括以下步骤：

(1)将上述由碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料制备的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，依次用甲醇、超纯水淋洗表面，去除表面吸附的杂质。

(2)将清洗后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有植物激素混合标准溶液水溶液中静止吸附1-30min。

(3)将吸附1-30min后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有甲醇溶剂的内插管中，超声解吸1-10min，取5-15μl进行lc－ms/ms分析。

本发明的碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料的制备方法和碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法与碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取方法同现有技术相比具有以下突出的有益效果：

1.通过将碳纳米纤维修饰在碳纤维上，形成空间立体三维结构，有效地增加活性位点，进而提高富集率，解决浓度低难以实现实时检测的难题。

2.本发明能够快速准确地分析植物激素，整个过程4分钟即可完成，实现了植物激素的快速分析。

3.本发明对探究各类激素间的相互关系，认识激素调控植物适应环境的机制，明确植物激素在植物各器官、细胞水平含量，对农作物品质调控、增产以及遗传育种等方面具有重要的指导意义。

附图说明

图1是碳纤维(左)，碳纳米纤维/碳纤维(右)的扫描电镜图；

图2是碳纳米纤维/碳纤维的透射电镜图；

图3是碳纤维(左)和碳纳米纤维/碳纤维(右)的o1s和c1s的x射线光电子能谱图；

图4是固相微萃取装置示意图；

图5是吸附时间对萃取效率的影响；

图6是脱附时间对萃取效率的影响；

图7是不同材料萃取性能对比。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将碳纤维除浆：除去碳纤维表面的上胶剂，然后放在烘箱中35-50℃干燥下15-30min，之后放入干燥器中储存；

(2)从干燥器中取出除浆之后的纯碳纤维(cfs)，用甲醇和水进行淋洗去除表面杂质。然后放在烘箱中35-50℃干燥下15-30min；

(3)碳纤维表面的酸性处理：将干燥后的碳纤维在常温常压下用体积比为1:3硝酸/硫酸溶液酸处理12-15h，使碳纤维表面富含羧基。酸化碳纤维(cfs-h)，用超纯水反复浸提，直至表面中性后，放在烘箱中干燥；

(4)催化剂在碳纤维表面上的沉积：将酸化碳纤维浸渍于已配好的催化剂溶液(正硅酸乙酯：表面活性剂(p123，pluronicp123,eo20po70eo20,mav＝5800)：h2o：乙醇：盐酸：硝酸镍＝1:0.0103:9.36:21.4:0.04:0.47)中48h；

(5)将已浸渍催化剂的碳纤维刷开后抽滤，用催化剂淋洗碳纤维，再抽滤。反复操作，直至碳纤维表面均匀的附着催化剂溶液；

(6)将第(5)步得到的碳纤维放在炉里在420-470℃煅烧20-60min；

(7)化学气相沉积法制备碳纳米纤维/碳纤维(cnfs/cfs复合纤维)：将催化剂均匀涂层于cfs-h表面的碳纤维放置于炉中，以2～20℃/min升温速率通入150-300cc/min流量的惰性气体(氮气、氩气或氦气)，并升温至500-700℃，然后通入10～50cc/min的h2，20-40min，还原催化剂，之后通入碳源乙炔20-40min(10～60cc/min)，化学气相沉积反应结束之后，关闭h2和乙炔，升温至700-900℃，通入100～200cc/min的co2气体30～120min，进行表面氧化处理，关闭co2气体，降温至室温。

本发明提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将碳纤维除浆：除去碳纤维表面的上胶剂，然后放在烘箱中40℃干燥20min，之后放入干燥器中储存；

(2)从干燥器中取出除浆之后的纯碳纤维(cfs)，用甲醇和水进行淋洗去除表面杂质。然后放在烘箱中40℃干燥20min；

(3)碳纤维表面的酸性处理：将干燥后的碳纤维在常温常压下用体积比为1:3硝酸/硫酸溶液酸处理12h，使碳纤维表面富含羧基。酸化碳纤维(cfs-h)，用超纯水反复浸提，直至表面中性后，放在烘箱中干燥；

(4)催化剂在碳纤维表面上的沉积：将酸化碳纤维浸渍于已配好的催化剂溶液(正硅酸乙酯：表面活性剂(p123，pluronicp123,eo20po70eo20,mav＝5800)：h2o：乙醇：盐酸：硝酸镍＝1:0.0103:9.36:21.4:0.04:0.47)中48h；

(5)将已浸渍催化剂的碳纤维刷开后抽滤，用催化剂淋洗碳纤维，再抽滤。反复操作，直至碳纤维表面均匀的附着催化剂溶液；

(6)将第(5)步得到的碳纤维放在炉里在450℃煅烧30min；

(7)化学气相沉积法制备碳纳米纤维/碳纤维(cnfs/cfs复合纤维)：将催化剂均匀涂层于cfs-h表面的碳纤维放置于炉中，以10℃/min升温速率通入200cc/min流量的惰性气体(氮气、氩气或氦气)，并升温至600℃，然后通入30cc/min的h2，30min，还原催化剂，之后通入碳源乙炔30min(20cc/min)，化学气相沉积反应结束之后，关闭h2和乙炔，升温至800℃，通入150cc/min的co2气体60min，进行表面氧化处理，关闭co2气体，降温至室温。

本发明还提供了由上述制备方法制备的碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法，该方法包括以下步骤：

(1)首先取一束长5-7cm修饰后的碳纳米纤维/碳纤维，依次用甲醇和超纯水淋洗。用超纯水将碳纳米纤维/碳纤维润湿，使碳纳米纤维/碳纤维聚成一簇。然后取4.5-5.5cm的ptfe管(内径为0.6-0.75mm)，清洗过程与清洗碳纳米纤维/碳纤维的过程相同。本实验选择ptfe管主要是因为ptfe易切割、更易于制作；

(2)将碳纳米纤维/碳纤维其中一端用聚丙烯腈pan进行固定，使碳纳米纤维/碳纤维一端由分散聚成尖端针形，确保其更容易装入聚四氟乙烯ptfe管，然后将碳纤维缓慢地装入ptfe管，整个过程一定要保证碳纳米纤维/碳纤维的完整性；

(3)将制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入装有甲醇的试管中保存，避免碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱接触空气，吸附空气中的杂质，将试管冷藏保存，需要时拿出；

(4)将商品化的固相微萃取装置进行改进，商品化的固相微萃取装置前端焊接一个纵向伸缩弹簧，弹簧一段为针型，确保其更容易进入植物样品内；

(5)制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱相当于萃取头，将其装入改进的带纵向弹簧的固相微萃取装置中。制备好的固相微萃取装置如图4中所示；

(6)实验时，将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，装入改进的商品化固相微萃取装置中。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置的制作方法，该方法包括以下步骤：

(1)首先取一束长6cm修饰后的碳纳米纤维/碳纤维，依次用甲醇和超纯水淋洗。用超纯水将碳纳米纤维/碳纤维润湿，使碳纳米纤维/碳纤维聚成一簇。然后取4.5cm的ptfe管(内径为0.75mm)，清洗过程与清洗碳纳米纤维/碳纤维的过程相同。本实验选择ptfe管主要是因为ptfe易切割、更易于制作；

(2)将碳纳米纤维/碳纤维其中一端用pan进行固定，使碳纳米纤维/碳纤维一端由分散聚成尖端针形，确保其更容易装入ptfe管，然后将碳纤维缓慢地装入ptfe管，整个过程一定要保证碳纳米纤维/碳纤维的完整性；

(3)将制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入装有甲醇的试管中保存，避免碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱接触空气，避免碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱吸附空气中的杂质，将试管冷藏保存，需要时拿出；

(4)将商品化的固相微萃取装置进行改进，商品化的固相微萃取装置前端焊接一个纵向伸缩弹簧，弹簧一段为针型，确保其更容易进入植物样品内；弹簧对碳纳米纤维/碳纤维起保护作用，既避免了萃取过程中的机械性伤害，也避免了大分子化合物的干扰。同时弹簧的伸缩振幅确保了碳纳米纤维/碳纤维足够的扩散空间，增大样品量，提高灵敏度，有利于定量分析；

(5)制备好的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱相当于萃取头，将其装入改进的带纵向弹簧的固相微萃取装置中。制备好的固相微萃取装置如图4中所示；

(6)实验时，将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，装入改进的商品化固相微萃取装置中。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取装置，该装置包括碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱，该微萃取柱装入前端带有纵向伸缩弹簧的固相微萃取装置中，其中所述碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱由上述的碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料制备，所述碳纳米纤维/碳纤维的一端用pan进行固定，使碳纳米纤维/碳纤维一端由分散聚成尖端针形，装入ptfe管。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取方法，该方法包括以下步骤：

(1)将由上述碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料制备的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，依次用甲醇、超纯水淋洗表面，去除表面吸附的杂质。

(2)将清洗后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有植物激素混合标准溶液水溶液中静止吸附1-30min。

(3)将吸附1-30min后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有甲醇溶剂的内插管中，超声解吸1-10min，取5-15μl进行lc－ms/ms分析。

本发明还提供了碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取方法，该方法包括以下步骤：

(1)将由上述碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取材料制备的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，依次用甲醇、超纯水淋洗表面，去除表面吸附的杂质。

(2)将清洗后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有植物激素混合标准溶液水溶液中静止吸附3min。

(3)将吸附3min后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有甲醇溶剂的内插管中，超声解吸1min，取10μl进行lc－ms/ms分析。

图1是对碳纤维和碳纳米纤维/碳纤维表征的扫描电镜图，使用扫描电子显微镜观察碳纤维的表面物理状态，在放大5000倍和10000倍时得到照片。从sem图上可以看出，碳纤维单丝直径均在8μm左右，碳纤维表面有沿纤维轴向的沟槽且宽度和深度不等。碳纳米纤维均匀的生长在碳纤维表面。

图2是对碳纳米纤维/碳纤维表征的透射电镜图，通过透射电镜我们观察碳纳米纤维的表面形貌。碳纳米纤维延碳纤维轴方向成一定角度均匀生长。

图3是对碳纤维和碳纳米纤维/碳纤维x射线光电子能谱图，定性、定量分析材料表面元素及其存在的形式，进一步评价我们制备的材料表面化学状态。

图3、表1对cfs和cnf/cfs的xps表征结果可以看到，cfs和cnf/cfs表面都存在c和o元素，但是cnf/cfs表面的碳元素含量比cfs表面的更多。

表1碳纤维和碳纳米纤维/碳纤维表面元素分析

吸附时间优化

固相微萃取(spme)是一种平衡萃取技术，样品萃取是spme过程的时间限制步骤，所以选择一个较优的萃取时间是spme方法开发过程中的关键步骤。吸附时间的选择是灵敏度和重现性与分析方法时长的一个折中。平衡萃取灵敏度最高，但时间要远长于预平衡时间。平衡和预平衡都要求精确和极好的时间重复性，但对后者来说时间更重要一点。在预平衡中极好的控制时间极为重要，因此本申请提及了吸附时间对萃取效率的影响。

将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，依次用甲醇、超纯水淋洗表面，去除表面吸附的杂质；将清洗后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有植物激素混合标准溶液水溶液中静止吸附(1min,3min,5min,15min,20min,30min)；然后将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有甲醇溶剂的内插管中，超声脱附10min，定容200μl，取10μl进lc－ms/ms分析，每个吸附时间平行三次。图5是吸附时间对萃取效率的影响，在3min后，三种植物激素的回收率基本稳定，均在70％以上，相对标准偏差(rsd)均小于10％。在3min后，已经达到了预平衡萃取，选择3min作为吸附时间。

脱附时间优化

离线脱附需要考虑几方面因素，如果需要提高灵敏度，溶剂的量就要尽可能少，但是要足够将纤维涂层完全浸没。但是，较大的溶剂体积能够得到更高效的脱附，最小化或者消除残留。通常离线脱附方法都是使用可以覆盖整个涂层长度的最小的脱附溶剂量来进行的。cantu等人脱附溶剂选择70μl流动相，在5～30min进行脱附时间检验，发现对目标物脱附来说20min足够了，进行空白检测也没有发现残留；hu等人采用超声处理，脱附溶剂选择甲醇，脱附溶剂体积为100μl,发现在3min实现了完全脱附；musteata等人仅用20μl乙腈-水-乙酸在塑料内插管内成功脱附了苯并二氮类物质；这些实例说明：脱附溶剂体积越小，灵敏度越高，但脱附时间也更长。使用大体积脱附溶剂会降低一些方法的灵敏度，但是能明显缩短完全脱附的时间。

将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱从溶剂中拿出，依次用甲醇、超纯水淋洗表面，去除表面吸附的杂质；将清洗后的碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有植物激素混合标准溶液水溶液中静止吸附3min；然后将碳纳米纤维/碳纤维微萃取柱放入含有甲醇溶剂的内插管中，超声脱附(1min,3min,5min,10min)，定容200μl，取10μl进lc－ms/ms分析，每个脱附时间平行三次。图6是脱附时间对萃取效率的影响，在1min后，三种植物激素的回收率基本稳定，均在70％以上，相对标准偏差(rsd)均小于8％。选取超声脱附1min，脱附溶剂为甲醇，脱附溶剂体积200μl作为脱附条件。

材料对比

为了进一步评价方法的萃取效果和灵敏度，将研制的碳纳米纤维/碳纤维(cnfs/cfs)固相微萃取新涂层与常见的玻璃纤维(sfs)和碳纤维(cfs)以及介孔二氧化硅涂层碳纤维(sio2/cfs)和碳纳米纤维/玻璃纤维(cnfs/sfs)做对比，结果如图7所示。玻璃纤维萃取能力最弱，碳纳米纤维/碳纤维萃取能力最强(玻璃纤维(sfs)＜碳纤维(cfs)＜介孔二氧化硅涂层碳纤维(sio2/cfs)＜碳纳米纤维/玻璃纤维(cnfs/sfs)＜碳纳米纤维/碳纤维(cnfs/cfs))；碳纳米纤维/碳纤维固相微萃取新涂层具有较好的重现性，相对标准偏差(rsd)小于4％。在玻璃纤维上修饰碳纳米纤维涂层(cnfs/sfs)对萃取性能有明显提高，但是玻璃纤维分散性没有碳纤维好，降低了碳纳米纤维的接触面积，导致回收率低于碳纳米纤维/碳纤维。将碳纳米纤维修饰在碳纤维上，形成空间立体三维结构，有效的增加活性位点，进而提高富集率，解决浓度低难以实现实时检测的难题。