一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法与流程

本发明属于理化检验
技术领域：
，具体涉及烟叶中玉米素核苷含量的测定方法。
背景技术：
：玉米素核苷是细胞分裂素在木质部中运输的重要形式，细胞分裂素是一类氮杂环的碱性小分子，主要功能是促进烟叶细胞的分裂和扩大，有研究表明细胞分裂素可以通过促进物质的积累和蛋白质与核酸的合成来阻止烟叶的衰老，细胞分裂素在烟草植物体内广泛分布。目前有关烟草内源植物细胞分裂素的检测方法主要有免疫分析法和色谱分析。其中免疫分析法有较低的检出限的优势，但需解决制备的抗体的交叉反应问题；目前色谱法运用最为广泛，虽然气相色谱-质谱、高效液相色谱等分析方法已经能够对植物组织或细胞提取液中的植物激素进行定量分析，但对于少量甚至微量植物样品中植物激素的同时检测还存在困难。主要原因，一是玉米素核苷激素的含量极低，通常都在ng/g数量级，如此低的含量要求其检测方法和仪器对植物激素具有超高的灵敏度；二是玉米素核苷激素不稳定、对温度和介质环境比较敏感；三是烟草植物体系基质十分复杂，直接检测会受到大量基质干扰物的影响。因此对样品处理方法的选择性和除杂能力有很高的要求，同时要求定量分析方法和仪器对目标植物激素有超高的灵敏度。但近年来，随着色谱与质谱联用技术快速发展，串联质谱(ms/ms)中母离子和子离子一一对应的多重反应监测模式可以有效去除因复杂基质干扰而引起的假阳性，相对于单级质谱法和高效液相色谱法，lc-ms/ms法是一种灵敏度更高，选择性更好、特异性更强的方法，在分析速度、灵敏度、选择性方面具有很好的优势。因此，通过对烟草这一复杂样品体系进行适当的前处理，对植物激素的选择性检测能力有极大提高，能够实现准确定性。烟叶中玉米素核苷的液液萃取-液相色谱-串联质谱分析方法未见公开报道，准确测定其含量，能为更好地了解烟草主要内源植物激素的生理功能和代谢途径，为烟草种植提供技术支持，提高基地烟叶产量和品质。技术实现要素：本发明弥补了现有分析技术的不足，提供一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法。本发明的技术方案是提供一种烟叶中玉米素核苷液液萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法，包括以下步骤：(1)提取液的制备：使用甲醇、水和甲酸，配制甲醇:水:甲酸溶液(80:19.9:0.1,v/v/v)作为提取液。(2)内标储备液配制：用甲醇配制氘代玉米素核苷(d2-zr)内标储备液，浓度为1000ng/ml。(3)标准储备液配制：用甲醇配制玉米素核苷(zr)标准储备液，浓度为100μg/ml。(4)样品前处理及分析：新鲜烟叶样品在液氮下研磨后储存于-50℃冰箱中备用。取处理后的新鲜烟叶样品于2ml离心管中,加入内标储备液(1000ng/ml)及提取液(甲醇:水:甲酸溶液＝80:19.9:0.1,v/v/v)，低温浸提，后加入萃取剂低温超声萃取，萃取液经过离心后，移取上层清液约900μl，氮吹浓缩至近干，用甲醇复溶，复溶液过有机膜后，样品试液进行lc-ms/ms测定。(5)标准曲线绘制：用的空白样品液稀释标准储备液配成系列浓度的工作标准溶液，制作标准曲线。工作标准溶液配置的系列浓度为1、5、10、20、50、100、200ng/ml，得7级工作标准溶液；zr及d2-zr采用正离子模式，对上述系列标准溶液进行lc-ms/ms分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得玉米素核苷的标准曲线。(6)数据处理与检测：由目标峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。进一步地，在步骤(4)中，称取处理后的烟叶样品量与加入内标储备液和提取液的总体积比为1:10(mg/μl)。进一步地，在步骤(4)中，称取的烟叶样品量为50mg。进一步地，在步骤(4)中，内标储备液中的标准物质为氘代玉米素核苷(d2-zr)。进一步地，在步骤(4)中，内标储备液和萃取液的加入量分别为50μl和500μl。进一步地，在步骤(4)中，浸提时间为12h，浸提温度为4℃。进一步地，在步骤中，萃取剂为乙酸乙酯，使用量为1ml，萃取时间为15min，萃取温度为4℃。进一步地，在步骤(4)中，离心操作条件为：离心转速为10000r/min，离心时间为5min，离心温度为4℃。进一步地，在步骤(4)中，有机滤膜为0.22μm聚四氟乙烯滤膜。进一步地，在步骤(4)中，使用确定不含玉米素核苷空白样品液稀释标准储备液配成系列浓度。进一步地，在步骤(4)或(5)中，lc-ms/ms测定时，高效液相色谱条件为：色谱柱：waterssymmetryc18，柱参数为150mm×3.9mm×5μm；预柱：waterssymmetryc18，柱参数10mm×3.9mm×5μm；进样量：20μl；柱温：25℃；流速为0.5ml/min；流动相a为0.1％甲酸；流动相b为甲醇:甲酸＝99.9:0.1(v/v)梯度洗脱程序为：进一步地，在步骤(4)或(5)中，质谱条件为：质谱检测采用esi离子源，在正离子扫描方式下，选择mrm工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：正离子模式下，电喷雾电压5500v；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气15psi，干燥温度600℃；目标物及内标的特征离子及参数分别为：本发明的有益效果是：本发明使用的仪器和设备均为实验室常规分析设备，发明方法易于推广，检测成本低；本发明采用同位素稀释内标法定量避免了复杂物体系定量分离、纯化的困难，也克服了基质效应的影响；本发明首次提出了采用液液萃取-液相色谱-串联质谱联用仪测定烟叶中玉米素核苷的分析方法，方法分析速度快，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。附图说明图1所示为玉米素核苷(zr)的提取离子流图。具体实施方式为便于更好的理解本发明，本发明结合具体的实施例进一步说明：仪器与试剂、材料：美国absciex4500lc-ms/ms；美国thermou3000hplc；waterssymmetryc18色谱柱(150mm×3.9mm,粒径5μm)，0.22μm微孔过滤膜，低温超声仪；超纯水(18mω)，乙酸乙酯、甲醇、甲酸(色谱纯，百灵威化学试剂公司),玉米素核苷及其内标标准物质(上海安谱实验科技股份有限公司)。提取液的制备：使用甲醇、水和甲酸，配制甲醇:水:甲酸溶液(80:19.9:0.1,v/v/v)作为提取液。配制内标储备液：用甲醇配制氘代玉米素核苷(d2-zr)内标储备液，浓度为1000ng/ml。配制标准溶液：用甲醇配制玉米素核苷(zr)标准储备液，浓度为100μg/ml。样品前处理：新鲜烟叶样品在液氮下研磨后储存于-50℃冰箱中备用。取约50mg处理后的新鲜烟叶样品于2ml离心管中,加入50μl内标工作溶液(1000ng/ml)及500μl的甲醇:水:甲酸溶液(80:19.9:0.1,v/v/v)于4℃浸提12小时，后加入1000μl乙酸乙酯于4℃超声萃取15min,萃取液于4℃以10000r/min离心5min，移取上层清液约900μl，氮吹浓缩至近干，用100μl甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜，样品试液待lc-ms/ms测定。高效液相色谱条件：色谱柱：waterssymmetryc18，柱参数为150mm×3.9mm×5μm；预柱：waterssymmetryc18，柱参数10mm×3.9mm×5μm；进样量：20μl；柱温：25℃；流速为0.5ml/min；流动相a为0.1％甲酸；流动相b为甲醇:甲酸＝99.9:0.1(v/v)；梯度洗脱程序如表1所示：表1高效液相色谱梯度洗脱条件质谱条件为：质谱检测采用esi离子源，在正离子扫描方式下，选择mrm工作模式进行二级质谱分析，优化后的主要质谱条件为：正离子模式下，电喷雾电压5500v；雾化气50psi，辅助加热气50psi，气帘气15psi，干燥温度600℃；目标物及内标的特征离子及参数见表2：表2玉米素核苷及内标的特征离子及参数标准曲线的绘制：用确定不含玉米素核苷的空白样品液稀释标准储备液配成系列浓度工作标准溶液，制作标准曲线。工作标准溶液配置的系列浓度为1、5、10、20、50、100、200ng/ml，得7级工作标准溶液；zr及d2-zr采用正离子模式，对上述系列标准溶液进行lc-ms/ms分析，以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析，求得玉米素核苷的标准曲线；玉米素核苷的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限如表3所示：表3玉米素核苷的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限化合物线性回归方程r2检出限(ng/g)定量限(ng/g)zry＝13.55x+0.70560.99940.1040.347精密度：为了考察方法的精密度，以烟叶样品进行6次日内重复实验，测定结果表明玉米素核苷日内测定结果的相对标准偏差在4.28％～6.70％之间，表明方法的日内精密度良好。同时，对样品进行了6天日间重复实验，测定结果表明玉米素核苷日间测定结果的相对标准偏差在5.65％～9.17％之间，结果表明该方法的日间重复性良好。回收率：采用样品加标法对烟叶样品在高、中、低三个含量水平上进行了回收率的测定，结果表明，玉米素核苷的平均回收率的结果在81.6％-109.4％之间，回收率较高，满足分析要求。实际样品的测定：采用本发明建立的方法测定了4个烟叶的玉米素核苷(表4),样品中玉米素核苷的含量范围为4.0-10.7ng/kg。表4烟叶中玉米素核苷的检测结果(ng/g)化合物1#2#3#4#zr6.34.09.110.7当前第1页12