一种四环素类抗生素痕量分析的新型固相萃取柱与应用的制作方法

本发明属于痕量抗生素技术领域，涉及一种用于水环境中四环素类抗生素痕量分析的新型固相萃取柱及其应用。

背景技术：

四环素类抗生素(tcs)是20世纪40年代发现的一类广谱抗生素，该类抗生素可以治疗革兰阳性和阴性细菌、细胞内支原体、衣原体和立克次氏体引起的感染，被广泛应用于疾病治疗和畜牧养殖。但是由于tcs在生物体内仅有很少一部分被生物吸收降解，绝大部分以母体形式排除体外，通过地表径流在自然界中迁移进入水环境中直接影响人类健康，同时环境中tcs的长期暴露会诱发抗性菌的产生和抗性基因的转移。因此，水环境中tcs的残留情况越来越多的受到人类关注。

目前tcs在地下水、地表水、水厂中普遍被检出，其中地表水中检出频率高达90％，浓度高达μg/l。其中四环素(tc)，土霉素(otc)，金霉素(ctc)，美他环素(mtc)，强力霉素(doc)作为第一代和第二代tcs，因其广谱、便于吸收且成本低，所以应用最为广泛。因此，建立水环境中tcs的痕量检测分析方法是对其开展有效控制的基础和前提。

对于水体中痕量tcs的检测分析，最常用的就是固相萃取法(spe)，而在spe过程中，固相萃取柱的选择是其中最重要的一环，目前常用的固相萃取柱主要有hlb柱和c18柱等，其中hlb柱的吸附剂是由亲脂性二乙烯基苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，对极性物质有着较好的保留效果，而c18柱是以硅胶为基质的反相c18萃取柱，适合于非极性物质的吸附保留。但是大多数文献显示，这些常用的固相萃取柱对四环素类抗生素的特异性不够，对tcs的回收率(10％～86.2％)并不是很理想。

因此，有必要开发针对tcs特异性吸附、成本低的新型固相萃取柱，以及配套的用于水环境中痕量tcs的检测分析。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于水环境中痕量tcs的检测方法，通过构建针对tcs特异性吸附，成本低的新型固相萃取柱，再配合优化后的填充质量、水样ph和洗脱溶剂等，综合提高了tcs的回收率，从而获得了较低的检出限和定量限。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的目的之一在于提供一种四环素类抗生素痕量分析的新型固相萃取柱，其特征在于，采用以下方法制备得到：

将2,3-萘二酚溶于二氯乙烷中，再加入二甲氧基甲烷，搅拌，加入无水氯化铁。反应液升温至80℃，并在此状态下保持24小时，冷却后，抽滤，收集固体，固体用甲醇洗涤，并用甲醇索氏提取，即得到目的产物ntdiol-pop。

进一步的，2,3-萘二酚、二氯乙烷、二甲氧基甲烷和无水氯化铁的添加量之比为10mmol：20ml：30mmol：40mmol。

本发明的目的之二在于提供一种用于水环境中痕量tcs的检测方法，包括以下步骤：

(1)新型固相萃取柱的装填：

往填料柱底部预放置垫片，再填充好ntdiol-pop填料，接着，采用垫片封住上部，即制成新型固相萃取柱；

(2)样品前处理：

取测试水样过滤除去悬浮物，调节ph并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；

(3)目标物tcs富集：

先对步骤(1)制备的新型固相萃取柱进行活化，再将步骤(2)得到的预处理后的水样过柱萃取富集，接着淋洗新型固相萃取柱，并真空干燥除去水分，再继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，纯化后转移至棕色进样瓶中待测；

(4)分析检测：

采用lc-ms/ms分析步骤(3)中定容后的样品，再由根据步骤(1)-步骤(3)中方法得到的标准工作曲线，即可得到目标物tcs与相应内标物的浓度比值，最后，将得到的浓度比值乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即得到测试水样中tcs的浓度。

进一步的，步骤(1)中，以容量为3ml的填料柱为计量基准，ntdiol-pop填料的装填量为50-200mg。

更进一步的，步骤(1)中，ntdiol-pop填料的装填量为100mg。

进一步的，步骤(1)中，填料柱与垫片的材质为pe或pp。

进一步的，步骤(2)中，ph值为5-11；

络合剂选用na2edta；

内标物选用100μg/l的tc-d6；

新型固相萃取柱依次采用等体积的甲醇和超纯水过柱活化；

淋洗过程所用的淋洗液为5～7％的甲醇/水溶液(v/v)；

真空干燥的时间为20～30min；

洗脱溶剂选用体积比5～7％的甲酸/甲醇溶液；

定容用的有机溶液采用50％的甲醇/水溶液(v/v)。

进一步的，所述的目标物tcs包括四环素、土霉素、金霉素、美他环素和强力霉素。

更进一步的，hplc-ms/ms分析时，质谱运行参数为：土霉素、四环素、金霉素、美他环素、强力霉素的母离子/定量子离子/碰撞能(ev)分别为461.3/426.4(16)，445.2/410.3(16)，479.2/444.2(20)，443.2/426.2(14)，445.2/428.1(16)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)采用的新型固相萃取柱，主要通过氢键以及静电吸附作用实现对5种tcs的特异性吸附，满足最终回收率在83.3～118.1％之间，且选择性强，抗基质效应强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的，实现了多种tcs的同时富集检测。

2)采用lc-ms/ms进行定量分析检测，灵敏度高，tcs的检出限均低于2.18ng/l，定量限均低于7.25ng/l，能够满足对饮用水中痕量内tcs的检测要求。

3)采用内标法测定tcs的浓度，线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。

4)前处理过程操作简单，环境友好。

附图说明

图1为本发明的流程示意图；

图2为本发明的新型固相萃取柱的结构示意图；

图3为不同ph条件下目标tcs在新填料色谱柱中的液相穿透曲线；

图4新型固相萃取柱填料质量优化图；

图5不同填料的固相萃取柱对目标tcs回收率；

图6前处理条件对目标tcs回收率的影响(a)水样ph值，(b)洗脱溶剂；

图7本发明目标tcs的总离子流图；

图8目标tcs及相应内标物(tc-d6)的提取色谱图；

图9基于新型固相萃取柱的分析方法在水源水下的基质效应。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明中以下内容中，所采用的ntdiol-pop填料由自己制备。在三口烧瓶中，将10mmol的2,3-萘二酚溶于20ml二氯乙烷中，再加入30mmol二甲氧基甲烷，搅拌5分钟后，加入40mmol无水氯化铁。反应液升温至80度，并在此状态下保持24小时。冷却后，抽滤，收集固体，固体用甲醇洗涤，并用甲醇索氏提取24小时，所得固体即为目标物ntdiol-pop。

所采用的tc-d6从多伦多研究化学品公司购买。

所采用的2,3-萘二酚从梯希爱(上海)化成工业发展有限公司购买。

采用如图1所示的流程而构建的一种用于水环境中痕量tcs的检测方法，包括以下步骤：

(1)新型固相萃取柱的装填：

往填料柱底部预放置垫片，再填充好ntdiol-pop填料，接着，采用垫片封住上部，即制成新型固相萃取柱；

(2)样品前处理：

取测试水样过滤除去悬浮物，调节ph并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；

(3)目标物tcs富集：

先对步骤(1)制备的新型固相萃取柱进行活化，再将步骤(2)得到的预处理后的水样过柱萃取富集，接着淋洗新型固相萃取柱，并真空干燥除去水分，再继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，纯化后转移至棕色进样瓶中待测；

(4)分析检测：

采用lc-ms/ms分析步骤(3)中定容后的样品，再由根据步骤(1)-步骤(3)中方法得到的标准工作曲线，即可得到目标物tcs与相应内标物的浓度比值，最后，将得到的浓度比值乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即得到测试水样中tcs的浓度。

上述检测方法中还包括样品前处理的优化等，主要为填料、ph条件和洗脱溶剂等的确定。

其中，各优化过程具体如下：

1、新型固相萃取柱

(1-1)新型固相萃取柱的装填

新型固相萃取柱采用ntdiol-pop材料自行填充，装填方法是在柱筒中预先放置一片垫片，然后填充一定质量的填料，最后再以垫片封住上部即可。成品固相萃取柱的模型图如图2所示

(1-2)萃取柱的穿透实验

通过液相色谱法快速预测新填料对tcs的穿透体积，计算新填料材料对tcs的富集倍数。具体为：取确定质量的新填料填充在空色谱柱中，压实活化备用。以确定浓度的目标样品为水相，甲醇为有机相，绘制新填料对目标物质的吸附效果。得到的穿透曲线如图3所示，实验结果表明，不同ph条件下新填料具有不同的穿透曲线，ph在5～7之间时，四环素能够很好保留，穿透时间在33min之后，吸附饱和量约为330mg/g，但随着ph的继续上升，穿透时间逐渐提前。吸附饱和量也在较小，当ph＝11时，四环素在20min发生穿透，吸附饱和量约为200mg/g。这对饮用水环境残留的痕量(ng/l)抗生素能够有效吸附且不会穿透。因此，可确定新填料适用于水环境中痕量tcs检测。

(1-3)新型固相萃取柱填料质量的优化

新型固相萃取柱的装填过程中，ntdiol-pop的填充质量需要进行优化。穿透实验已经证明100mg填料的饱和吸附量足够大，本发明根据新型固相萃取柱的填料厚度选择质量为50mg，100mg，150mg，200mg的四种情况进行优化。实验结果如图4所示：填充量为100mg时，tcs回收率最佳，处于83.3～118.1％之间。但填充量为50mg时，填料过薄，固相萃取过程中接触时间太短，导致吸附过程中有损失，而当填充量为150mg以上，填料过厚，在洗脱时阻力增大，可能导致洗脱过程中有损失。所以，综合考虑，填充量为100mg时，新型固相萃取柱的性能最佳，可实现对tcs的有效富集且满足环境样品加标回收率的控制限要求。

(1-4)spe小柱填料的对比

固相萃取柱的选择取决于柱填料与目标物上官能团的相互作用，为实现每种tcs富集效率最大化，本发明根据经验选择了4种不同柱填料(isolutec18、反相/离子交换混合模式色谱填料(hce-c18)、oasishlb和新填料)进行对比实验，结果见图5。实验结果表明：在4种spe柱中，经过新填料固相萃取柱富集时，所有的目标tcs的萃取回收率都位于83.3～118.1％之间，可实现对tcs的有效富集且满足环境样品加标回收率的控制限要求。

相对于传统的固相萃取柱，新填料萃取柱可以通过氢键，π-π键和静电吸附作用实现对tcs的吸附，选择性高，特异性强，所以相对稳定高效。

2、样品前处理优化

(2-1)最佳ph的确定

由于目标tcs为酸碱两性化合物，ph的变化会影响目标tcs和新填料之间的静电作用，故本发明选择水样ph为3.0、5.0、7.0、9.0、进行优化，结果见图6(a)。实验结果表明：ph为5.0时，目标tcs的回收率在83.3％～118.1％之间，因此本发明选择ph值为5.0的水样条件完成对目标tcs的萃取和富集。

(2-2)洗脱溶剂的确定

由于新填料对tcs的吸附作用主要通过氢键，π-π键和静电吸附，而酸性条件会显著减弱静电作用，所以本发明考察了不同体积比的甲酸/甲醇(v/v)作为洗脱溶剂对tcs回收率的影响。结果见图6(b)。实验结果表明：当洗脱溶剂不含甲酸时，tcs回收率都为0％；当洗脱溶剂为1％甲酸/甲醇(v/v)时，tcs的回收率稍有改善(20～40％)；而当洗脱溶剂为5～7％甲酸/甲醇(v/v)时基本达到76.3～114.7％之间，符合痕量分析要求。因此洗脱溶剂最优选择为5～7％甲酸:甲醇(v/v)。

3、检测方法优化

液相色谱-串联质谱仪能够利用特征碎片离子准确定量，在优化的母离子/子离子条件下。5种tcs在esi正离子模式下的总离子流色谱图见图7，各四环素的提取色谱图见图8。由图可见，每一种目标物在该优化条件下的提取色谱峰峰形完好，响应值高，为后续水源水中抗生素的定量分析工作提供了可靠保证。hplc-ms/ms分析时，质谱运行参数为，土霉素(otc)，四环素(tc)，金霉素(ctc)，美他环素(mtc)，强力霉素(doc)的母离子/定量子离子/碰撞能(ev)分别为461.3/426.4(16)，445.2/410.3(16)，479.2/444.2(20)，443.2/426.2(14)，445.2/428.1(16)。

实施例1

首先，确定基于本发明的检测方法的标准工作曲线，具体步骤如下：

(a)配制混合标准储备液：用50％甲醇/水溶液(v/v)将5种tcs配制成100mg/l的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；同时将tc-d6配制成100mg/l的储备液，置于棕色试剂瓶中，待用。

(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)中混合标准储备液稀释为不同浓度梯度：1、2、4、10、20、40、100、200和500μg/l，同时向各浓度梯度样品中加入tc-d6溶液，使各浓度梯度中含有等浓度的(100μg/l)的内标溶液；

(c)采用lc-ms/ms对各浓度梯度样品进行分析，采用上述优化后的液相色谱运行参数和质谱运行参数运行lc-ms/ms，以每种tcs与相应内标物浓度比值为横坐标，以分析得出的每种tcs定量子离子与内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制5种tcs的标准工作曲线。

方法检出限与方法定量限通过信噪比(signal-to-noise，s/n)来计算，以3倍信噪比为方法检出限(limitofdetection，lod)，10倍信噪比为方法定量限(limitofquantitation，loq)。本方法的线性范围、相关系数、检出限和定量限结果见表2。

结果表明目标物质在优化的仪器条件下线性相关性良好，线性相关系数r²>0.99。目标物质的方法检出限范围为0.078～2.18ng/l，方法定量限范围为0.26～7.25ng/l，低浓度水平的检出限与定量限，保证了该分析方法检测水环境中痕量tcs的可能性。

表1目标四环素类抗生素检出限和定量限

继续根据本发明的检测方法进行四环素类抗生素痕量分析，具体步骤如下：

(1)样品预处理：

选取华东地区某水源地水样进行实验，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调ph为5.0并加入络合剂na2edta，完成预处理，同时用超纯水作为空白对照。

(2)目标物tcs浓缩富集：

先用5ml等体积的甲醇和超纯水依次通过新型固相萃取柱，进行活化，再取1000ml步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10ml甲酸/甲醇溶液(7％/93％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为40℃，在氮气流下吹干，之后用100μg/l的标准溶液溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)仪器分析检测：

采用lc-ms/ms分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机流动相为含有0.1％甲酸/乙腈溶液(v/v)，水相为含有0.1％甲酸/纯水溶液(v/v)，梯度洗脱程序为：0～5min时，由85％(85％水相/25％有机相)的水相线性降低到75％，在5～10min时，水相线性降低到55％，在10～14min时，水相上线性升到85％，在14～15min时，水相在85％保持1min；进样流速为0.4ml/min，进样体积为10μl。

最后，基于新型固相萃取柱的分析方法在水源水下的基质效应如图9所示。可以发现，在水源地水基质中，ntdiol-pop表现出明显的抗基质干扰能力。除了otc是基质增强效应外(-27.0％)，其他四种tcs均表现为基质抑制(-8.4％～3.7％)，但是对比其他四种萃取材料的基质效应(-24.2％～67.5％)，这种基于新型固相萃取柱的分析方法收到的影响更小。

实施例2

根据本发明的方法继续检测水源地中典型的5种四环素类抗生素，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

选取华东地区某水源地水样，采用0.7μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调ph为5.0并加入络合剂na2edta，再加入100μg/l的内标tc-d6，完成预处理；

(2)目标物tcs浓缩富集：

先用5ml等体积的甲醇和超纯水依次通过新型固相萃取柱，进行活化，再取1000ml步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后继续用10ml甲酸/甲醇溶液(7％/93％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为40℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)仪器分析检测同实施例1。

最后，实施例1与实施例2所实际检测的华东地区水源水样品检测结果如表2。

表2华东地区某两个水源地中tcs残留情况

备注：nd代表未检出

根据以上实验结果可知，本发明所构建的检测方法已成功用于华东地区水源地中tcs的分析检测，在三个水源地中，otc，tc有检出，且最高检出浓度为otc(42.87ng/l)，对比来看，水源地3的污染水平(8.63ng/l～42.87ng/l)高于水源地2(9.16～38.11ng/l)高于水源地1(1.74～13.03ng/l)。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。