生物体肝脏组织中脂质的提取和检测方法与流程

本申请涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种生物体肝脏组织中脂质的提取和检测方法。

背景技术：

肝脏作为机体脂质代谢和炎症控制的重要器官，人们对肝脏脂类代谢组学的研究日益广泛和深入。随着分析技术的进步，针对脂质化合物的分析技术不断完善和提高，脂质类化合物能够更好、更全面的被表征、鉴定及定量分析。基于脂质组学分析技术揭示脂质代谢异常与疾病的相关性，寻找潜在生物标志物是目前研究的热点。根据研究模式不同，可将脂质代谢组学分为非靶向和靶向脂质代谢组学，非靶向脂质代谢是从全局分析的角度将样本中所有的代谢物质识别出来，该研究模式的优势在于全面寻找有差异的代谢物，其缺点是对代谢物识别的准确性不高，只能进行半定量测定。理想的非靶向脂质代谢组学样品采集和制备方法应满足：①非选择萃取出样品中含尽可能多的代谢物；②简便、快速、尽量避免或减少代谢物丢失或降解；③方法重现性和稳定性好；④有样品淬灭步骤，以确保代谢轮廓的真实性。而靶向代谢组学的特点则是利用相应的标准品对既定的一组代谢物质进行精确的定性定量分析，两者互相结合，使得脂质代谢组学研究结果更加完善。

由于生物样本的稀缺性和不可复得性，以及可供使用的样品量很少，而且基质复杂，同时由于内源性代谢物种类多，性质差异大，如何针对一份微量样本通过一种前处理方法一次分析完成各类脂质代谢物的测定是研究的难点。对于肝脏组织等脂质含量较多的生物样本，较为常用的提取方法包括经典的folch法及由其衍生出的bligh-dyer法，这两种方法均是以氯仿和甲醇为有机相的两相提取法，具有操作简单、提取效率高的特点，但是氯仿具有毒性大的缺点，容易造成对操作人员的潜在危害。

针对目前常用组织提取方法存在的组织样本用量大、提取效率低、提取溶剂毒性大，以及现有检测方法在肝脏组织中检测分析出的脂质数量少，种类少的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现要素：

本申请的主要目的在于提供一种生物体肝脏组织中脂质的提取和检测方法，以解决目前常用组织提取方法存在的组织样本用量大、提取效率低、提取溶剂毒性大，以及现有检测方法在肝脏组织中检测分析出的脂质数量少，种类少的问题。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种生物体肝脏组织中脂质的提取方法，包括以下步骤：取肝脏组织进行组织匀浆；加入甲基叔丁基醚和甲醇进行脂质萃取；取上层有机相再次加入甲基叔丁基醚和甲醇二次萃取；取上层有机相，完成脂质提取。

进一步的，所述组织匀浆步骤包括：准确称取肝脏组织于离心管中加水，离心管中加入钢球，间隔匀浆，间隔时冷却，匀浆后取出钢珠，得到均匀的肝脏组织匀浆液。

进一步的，加入钢球的数量为每离心管2～3个，组织匀浆时转速为2000～3000rpm，每次匀浆5～10s，间隔5～10s后再匀浆，反复匀浆10～12次，间隔时将离心管置于冰块中冷却。

进一步的，加入所述甲基叔丁基醚和甲醇的比例为5：1～6：1。

进一步的，所述萃取步骤包括：加入甲基叔丁基醚和甲醇后旋涡30～40s，超声10～20min，在3000～4000rpm转速下离心10～15min。

为了实现上述目的，根据本申请的另一个方面，提供了一种生物体肝脏组织中脂质的检测方法，利用上述的提取方法对生物体肝脏组织中的脂质进行前处理。

进一步的，对所述生物体肝脏组织中的脂质进行前处理后利用色谱-质谱联用方法进行脂质检测。

进一步的，将两次萃取后的上层有机相氮吹至干，加入甲醇复溶，在12300-13000rpm转速下离心1-2min，取上清液进样。

进一步的，使用qexactive高分辨液质联用仪进行检测。

进一步的，色谱条件为：hypersilgoldc18色谱柱，50mm×2.1m×1.9μm；柱温40℃；正离子模式：流动相a为乙腈:10mm甲酸铵水溶液，所述甲酸铵水溶液中含有0.1％甲酸，乙腈与甲酸铵水溶液的比例为1.5:1，流动相d为异丙醇：乙腈，异丙醇与乙腈的比例为9:1；负离子模式：流速为0.3ml/min；进样体积为2μl；流动相梯度为：流动相a为乙腈:10mm乙酸铵水溶液，乙腈与甲酸铵水溶液的比例为1.5:1，流动相d为异丙醇：乙腈，异丙醇与乙腈的比例为9:1；梯度洗脱程序：0min，85％a：15％d；0～2min，70％a：30％d；2～2.5min，52％a：48％d；2.5～11min，18％a：82％d；11～11.5min，1％a：99％d；11.5～12min，1％a：99％d；12～12.1min，85％a：15％d,12.1～15min，85％a：15％d；质谱条件为：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375℃，离子喷雾电压为3500v，鞘气流速为40arb，辅助气为10arb，反吹气为0，s-lensrf为50；辅助气压：10arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用fullms/ddms2+discovery，正离子模式和负离子模式分别进样，此模式包含分辨率为70000的一级全扫描和数据依赖的分辨率为17500的二级扫描，扫描范围为100～1500m/z，一级扫描自动增益控制为1.0e6，离子注入时间为100ms；数据依赖的二级扫描自动增益控制设为1.0e5，最大离子注入时间设为100ms，隔离窗口设为3.0m/z，碰撞能量设为40ev，loopcount设为3，动态排除设为10.0s。

在本申请实施例中，采用毒性小的甲基叔丁基醚和甲醇作为提取溶剂对生物体肝脏组织中脂质进行提取，通过这种前处理方式，非选择萃取出小鼠肝脏组织中脂质的数量多，涵盖脂类化合物种类多，达到了操作简便、快速提取的目的，采用q-exactive台式四极杆-轨道阱高分辨液质联用仪对提取出的脂质进行检索分析，分辨率高、质量数精确、全扫描灵敏度高、提取特征峰数量大，检测出30种脂质，上千个脂类化合物，脂类代谢物识别准确性高。进而解决了目前常用组织提取方法存在的组织样本用量大、提取效率低、提取溶剂毒性大，以及现有检测方法在肝脏组织中检测分析出的脂质数量少，种类少的问题。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请实验例1中样本正离子模式tic图；

图2是本申请实验例1中样本负离子模式tic图；

图3是本申请实验例2中样本正离子模式tic图；

图4是本申请实验例2中样本负离子模式tic图；

图5是本申请实验例3中对照组样品正离子模式tic图；

图6是本申请实验例3中对照组样品负离子模式tic图；

图7是本申请实验例4中对照组样品正离子模式tic图；以及

图8是本申请实验例4中对照组样品负离子模式tic图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤的过程不必限于清楚地列出的那些步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程固有的其它步骤。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

实施例1

一种生物体肝脏组织中脂质的提取方法，包括以下步骤：

(1)准确称取肝脏组织于离心管中加水，每个离心管中加入2个钢球，组织匀浆时转速为2000rpm，每次匀浆10s，间隔10s后再匀浆，反复匀浆12次，间隔时将离心管置于冰块中冷却得到均匀的肝脏组织匀浆液；

(2)在肝脏组织匀浆液中加入甲基叔丁基醚和甲醇，比例为5：1，旋涡30s，超声10min，在3000rpm转速下离心15min；

(3)取上层有机相到新的ep管，重复操作步骤(2)，完成二次萃取，取上层有机相，完成脂质提取。

将两次萃取后有机相于氮吹仪氮吹至干，加入甲醇复溶，12300rpm离心2min，取上清液加入进样小瓶。

实施例2

一种生物体肝脏组织中脂质的提取方法，包括以下步骤：

(1)准确称取肝脏组织于离心管中加水，每个离心管中加入3个钢球，组织匀浆时转速为3000rpm，每次匀浆5s，间隔5s后再匀浆，反复匀浆10次，间隔时将离心管置于冰块中冷却得到均匀的肝脏组织匀浆液；

(2)在肝脏组织匀浆液中加入甲基叔丁基醚和甲醇，比例为6：1，旋涡40s，超声20min，在4000rpm转速下离心10min；

(3)取上层有机相到新的ep管，重复操作步骤(2)，完成二次萃取，取上层有机相，完成脂质提取。

将两次萃取后有机相于氮吹仪氮吹至干，加入甲醇复溶，13000rpm离心1min，取上清液加入进样小瓶。

实施例3

一种生物体肝脏组织中脂质的检测方法，利用实施例1的提取方法对生物体肝脏组织中的脂质进行前处理，使用qexactive高分辨液质联用仪进行检测，其中，

色谱条件为：hypersilgoldc18色谱柱，50mm×2.1m×1.9μm；柱温40℃；正离子模式流动相梯度为：流动相a为乙腈:10mm甲酸铵水溶液，所述甲酸铵水溶液中含有0.1％甲酸，乙腈与甲酸铵水溶液的比例为1.5:1，流动相d为异丙醇：乙腈，异丙醇与乙腈的比例为9:1；负离子模式：流速为0.3ml/min；进样体积为2μl；流动相梯度为：流动相a为乙腈:10mm乙酸铵水溶液，乙腈与甲酸铵水溶液的比例为1.5:1，流动相d为异丙醇：乙腈，异丙醇与乙腈的比例为9:1；梯度洗脱程序：0min，85％a：15％d；0～2min，70％a：30％d；2～2.5min，52％a：48％d；2.5～11min，18％a：82％d；11～11.5min，1％a：99％d；11.5～12min，1％a：99％d；12～12.1min，85％a：15％d；12.1～15min，85％a：15％d。

质谱条件为：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375℃，离子喷雾电压为3500v，鞘气流速为40arb，辅助气为10arb，反吹气为0，s-lensrf为50；辅助气压：10arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用fullms/ddms2+discovery，正离子模式和负离子模式分别进样，此模式包含分辨率为70000的一级全扫描和数据依赖的分辨率为17500的二级扫描，扫描范围为100～1500m/z，一级扫描自动增益控制为1.0e6，离子注入时间为100ms；数据依赖的二级扫描自动增益控制设为1.0e5，最大离子注入时间设为100ms，隔离窗口设为3.0m/z，碰撞能量设为40ev，loopcount设为3，动态排除设为10.0s。

实验例1小鼠肝脏组织中脂质的提取分析实验1

1.样本采集

从-80℃冰箱取出肝脏组织置于室温，准确称取肝脏组织0.0413、0.0415、0.0421、0.0415、0.0411、0.0422、0.0416、0.0422、0.0417、0.0415g，10个样本分别置于2ml离心管中。

2.组织匀浆

每个离心管中加入200ul色谱级水，每个离心管加入3个钢球，组织匀浆(2000rpm，10s/10s，12次)，每次匀浆10s，间隔10s再匀浆，间隔时置于冰块中冷却，匀浆后取出钢珠，得到均匀的肝脏组织匀浆液，每个离心管取出18ul混匀，2个qc平行组(qc1，qc2)，每10个样品插一个qc；

3.提取

qc和10个样本分别加入400ul甲基叔丁基醚和80ul甲醇，漩涡30s，超声10min；3000rpm离心15min，中间有白色分离层，取200ul上层有机相甲基叔丁基醚到新的ep管，重复1次萃取；两次萃取后有机相在氮吹仪(eyelamg-2200，日本)氮吹至干，加入100ul甲醇复溶，12300rpm离心2min，取上层清液加入进样小瓶(附有250ul内衬管)。

4.分析

色谱仪选用thermofisher公司的qexactive高分辨液质联用仪(lc：uhplcdionexultimate3000，ms：q-orbitrapmassspectrometer，usa)；色谱柱选择thermofisher反相c18色谱柱(hypersilgoldc1850mm×2.1m×1.9μmcolumn,thermofisher,usa)，柱温为40℃；

正离子模式：流动相a为乙腈:水(10mm甲酸铵+0.1％甲酸)＝60/40(v/v)，流动相d为异丙醇：乙腈＝90/10(v/v)；

负离子模式流速为0.3ml/min，进样体积为2μl；流动相梯度为：流动相a为乙腈:水(10mm乙酸铵)＝60/40(v/v)，流动相d为异丙醇：乙腈＝90/10(v/v)；批量进样时，先用5-10针qc稳定仪器，每隔10个样，进一针qc，进样时样品顺序打乱随机进样；

梯度洗脱程序：时间(min)a(％)d(％)：0min,85％a：15％d，0～2min，70％a：30％d，2～2.5min，52％a：48％d，2.5～11min，18％a：82％d，11～11.5min，1％a：99％d，11.5～12min，1％a：99％d，12～12.1min，85％a：15％d；12.1～15min，85％a：15％d。

其中，质谱条件为：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375℃，离子喷雾电压为3500v，鞘气流速(shealthgas)为40arb，辅助气(auxgas)为10arb，反吹气(sweepgas)为0，s-lensrf为50；辅助气压：10arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用fullms/ddms2+discovery，一级全扫描(分辨率70000)和数据依赖的二级扫描(分辨率17500)，扫描范围为m/z100～1500，一级扫描自动增益控制(agc)为1.0e6，离子注入时间(it)为100ms；数据依赖的二级扫描(dd-ms2)的(agc)设为1.0e5，最大it设为100ms，隔离窗口设为3.0m/z，(n)ce碰撞能量设为40，loopcount设为3，动态排除设为10.0s。

5.结果分析

样品正离子模式tic图如图1(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：正离子模式响应最高达到4.13e9，可提取出19187个特征峰，2724个特征峰被鉴定，其中1026个特征峰有ms2信息。

样品负离子模式tic图如图2(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：负离子模式最高响应达到1.83e10，可提取出13140个特征峰，1583个特征峰被鉴定，其中921个特征峰有ms2信息。

可见基于qexactive高分辨液质联用仪的非靶向脂质组学分析出脂质数量多，涵盖30种脂质(包括sm、ps、pe、pc、hexcer、dgts、cer、sm、tag、sqdg、pg、mgdg、g1、dgdg、dag、cl、bmp、acy、mag、lpe、lpc、ldgts、ce、acar、fahfa、oxfa、oxpc、oxpe、pa、pg)，灵敏度高，精确度高。

实验例2小鼠肝脏组织中脂质的提取分析实验2

1.样本采集

从-80℃冰箱取出肝脏组织置于室温，准确称取肝脏组织0.0456、0.0452、0.0446、0.0447、0.0452、0.0461、0.0449、0.0443、0.0453、0.0457、0.0456、0.0445、0.0442、0.0457、0.0442、0.0451、0.0459、0.0461、0.0453、0.0455g，20个样本分别置于2ml离心管中。

2.组织匀浆

每个离心管加入200ul色谱级水，每个离心管加入3个钢球，组织匀浆(2000rpm，10s/10s，12次)，每次匀浆10s，间隔10s再匀浆，间隔时置于冰块中冷却，匀浆后取出钢珠，得到均匀的肝脏组织匀浆液，每个离心管取出18ul混匀，3个qc平行组(qc1，qc2，qc3)，每10个样品插一个qc；

3.提取

qc和样本分别加入400ul甲基叔丁基醚和80ul甲醇，漩涡30s，超声10min；3000rpm离心15min，中间有白色分离层，取200ul上层有机相甲基叔丁基醚到新的ep管，重复1次萃取；两次萃取后有机相在氮吹仪(eyelamg-2200，日本)氮吹至干，加入100ul甲醇复溶，12300rpm离心2min，取上层清液加入进样小瓶(附有250ul内衬管)。

4.分析

色谱仪选用thermofisher公司的qexactive高分辨液质联用仪(lc：uhplcdionexultimate3000，ms：q-orbitrapmassspectrometer，usa)；色谱柱选择thermofisher反相c18色谱柱(hypersilgoldc1850mm×2.1m×1.9μmcolumn,thermofisher,usa)，柱温为40℃；

正离子模式：流动相a为乙腈:水(10mm甲酸铵+0.1％甲酸)＝60/40(v/v)，流动相d为异丙醇：乙腈＝90/10(v/v)；

负离子模式流速为0.3ml/min，进样体积为2μl；流动相梯度为：流动相a为乙腈:水(10mm乙酸铵)＝60/40(v/v)，流动相d为异丙醇：乙腈＝90/10(v/v)；批量进样时，先用5-10针qc稳定仪器，每隔10个样，进一针qc，进样时样品顺序打乱随机进样；

梯度洗脱程序：时间(min)a(％)d(％)：0min,85％a：15％d，0～2min，70％a：30％d，2～2.5min，52％a：48％d，2.5～11min，18％a：82％d，11～11.5min，1％a：99％d，11.5～12min，1％a：99％d，12～12.1min，85％a：15％d；12.1～15min，85％a：15％d。

其中，质谱条件为：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375℃，离子喷雾电压为3500v，鞘气流速(shealthgas)为40arb，辅助气(auxgas)为10arb，反吹气(sweepgas)为0，s-lensrf为50；辅助气压：10arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用fullms/ddms2+discovery，一级全扫描(分辨率70000)和数据依赖的二级扫描(分辨率17500)，扫描范围为m/z100～1500，一级扫描自动增益控制(agc)为1.0e6，离子注入时间(it)为100ms；数据依赖的二级扫描(dd-ms2)的(agc)设为1.0e5，最大it设为100ms，隔离窗口设为3.0m/z，(n)ce碰撞能量设为40，loopcount设为3，动态排除设为10.0s。

5.结果分析

样品正离子模式tic图如图3(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：正离子模式响应最高达到5.04e9，可提取出18765个特征峰，2810个特征峰被鉴定，其中1102个特征峰有ms2信息；

样品负离子模式tic图如图4(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：负离子模式最高响应达到1.47e10，可提取出12950个特征峰，1497个特征峰被鉴定，其中892个特征峰有ms2信息；

可见基于qexactive高分辨液质联用仪的非靶向脂质组学分析出脂质数量大，涵盖27种脂质(包括sm、ps、pe、pc、hexcer、dgts、cer、sm、tag、sqdg、pg、mgdg、g1、dgdg、dag、cl、bmp、acy、mag、lpe、lpc、ldgts、ce、acar、glcadg、shexcer、gm3)，灵敏度高，准确性高。

实验例3小鼠肝脏组织中脂质的提取效果对照实验

一、实验方法

实验样品分为实验组和对照组：

实验组按照实验例1中记载的方法处理；

对照组控制实验例1中控制其他步骤不变，组织匀浆和提取步骤如下：

于盛装有精确质量肝脏组织的离心管中加入甲醇：水(4：3)，每个离心管加入3个钢球，组织匀浆(2000rpm，10s/10s，12次)，每次匀浆10s，间隔10s再匀浆，间隔时置于冰块中冷却，匀浆后取出钢珠，得到均匀的肝脏组织匀浆液，加入800ul氯仿提取，匀浆液在37度温育20min，12300rpm离心20min，下层有机相转移到新的ep管，真空干燥，加入100ul甲醇：氯仿(1：1)溶液复溶，12300rpm离心2min，取上层清液加入进样小瓶(附有250ul内衬管)。

二、实验结果

实验组实验结果参见实验例1。

对照组：样品正离子模式tic图如图5(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：正离子模式响应最高达到1.36e9，可提取出9765个特征峰，1010个特征峰被鉴定，其中509个特征峰有ms2信息；样品负离子模式tic图如图6(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示：负离子模式最高响应达到4.68e9，可提取出6653个特征峰，797个特征峰被鉴定，其中263个特征峰有ms2信息。

三、结果分析

根据上述实验结果对比表明，相比采用氯仿提取的方式，采用本申请提供的肝脏组织脂质提取方法，鉴定出来的特征峰数量明显增加，证明本申请提供的方法非选择性萃取出样品中的脂质数量多，涵盖脂类化合物种类多，提效率高，使用毒性较小的mtbe代替氯仿进行脂质提取，减少了对操作人员的潜在危害。

实验例4小鼠肝脏组织中脂质的提取分析效果对照实验

一、实验方法

实验样品分为实验组和对照组：

实验组按照实验例1中记载的方法处理；

对照组控制实验例1中控制其他步骤不变，仪器条件如下：

色谱仪选用thermofisher公司的qexactive高分辨液质联用仪(lc：uhplcdionexultimate3000，ms：q-orbitrapmassspectrometer，usa)；色谱柱选择thermofisher反相c18色谱柱(hypersilgoldc1850mm×2.1m×1.9μmcolumn,thermofisher,usa)，柱温为40℃；

正离子模式：流动相a为0.1％甲酸水，流动相d为乙腈；

负离子模式流速为0.3ml/min，进样体积为2μl；流动相梯度为：流动相a为0.05％氨水，流动相d为乙腈；批量进样时，先用5-10针qc稳定仪器，每隔10个样，进一针qc，进样时样品顺序打乱随机进样；

梯度洗脱程序：时间(min)a(％)d(％)：0min,85％a：15％d，0～2min，70％a：30％d，2～2.5min，52％a：48％d，2.5～11min，18％a：82％d，11～11.5min，1％a：99％d，11.5～12min，1％a：99％d，12～12.1min，85％a：15％d；12.1～15min,85％a：15％d。

其中，质谱条件为：电离方式为电喷雾离子源，离子源温度为375℃，离子喷雾电压为3500v，鞘气流速(shealthgas)为40arb，辅助气(auxgas)为10arb，反吹气(sweepgas)为0，s-lensrf为50；辅助气压：10arb，喷雾气和碰撞气均为氮气，扫描方式采用fullms/ddms2+discovery，一级全扫描(分辨率70000)和数据依赖的二级扫描(分辨率17500)，扫描范围为m/z100～1500，一级扫描自动增益控制(agc)为1.0e6，离子注入时间(it)为100ms；数据依赖的二级扫描(dd-ms2)的(agc)设为1.0e5，最大it设为100ms，隔离窗口设为3.0m/z，(n)ce碰撞能量设为30，loopcount设为1，动态排除设为10.0s。

二、实验结果

实验组实验结果参见实验例1。

对照组：样品正离子模式tic图如图7(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示，正离子模式可提取出12569个特征峰，2012个特征峰被鉴定，其中865个特征峰有ms2信息；样品正离子模式tic如图8(横坐标time为保留时间，纵坐标relaiveabundance为相对丰度)所示所示，样品负离子模式可提取出可提取出9956个特征峰，1236个特征峰被鉴定，其中612个特征峰有ms2信息；

三、结果分析

根据上述实验结果对比表明，采用对照组的仪器条件进行仪器分析时，鉴定出的特征峰数量相比实验组略少，但仍能实现较好的分析识别效果，并且采用本申请实验例1中提供的仪器条件进行仪器分析时脂质识别准确性和灵敏度更高。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。