专利名称：：脂质代谢改善剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种脂质代谢改善剂，其包含作为活性成分的杆菌属(genus5"c/〃m)细菌的细胞或培养物、尤其是枯草杆菌(Sad〃ma、M6"fo)C-3102细菌的细胞或培养物，且具有降低血清甘油三酯的作用。
背景技术：
：升高的血清甘油三酯水平是例如高脂血症、动脉硬化、缺血性心脏病(心绞痛和心肌一更塞)和糖尿病的疾病开始的主要因素，且一般是生活方式疾病的指示。而且，已知中性脂肪水平的餐后升高和维持在较高水平是影响心血管疾病的最大的因素。限制脂质摄取的药物治疗和饮食治疗一般是治疗高脂血症所选择的。例如HMG-CoA还原酶抑制剂的药物(例如，美伐他汀)和胆汁酸吸附剂(阴离子交换树脂)用于药物治疗，其中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂的药物通过抑制槲斗酸(va]onicacid)从3-羟基-3-甲基戊二酰基辅因子A(HMG-CoA)的生物合成来抑制胆固醇的生物合成。但是，HMG-CoA还原酶抑制剂具有副作用，例如，过敏反应、肝功能异常和横紋肌溶解。另外，当使用例如考来烯胺(cholestyramine)的阴离子交换树脂时，阴离子交换树脂吸附胆汁酸，胆汁酸在消化道内含有许多胆固醇，从而阻塞肠肝循环，并导致从身体排泄胆固醇。但是，阴离子交换树脂难于大剂量吞咽。而且，它们可能导致便秘和消化道症状。至于饮食治疗，该方法由于饮食限制而伴随精神苦闷，使其难于持续超过延长期限。'因此，需要具有降低血清甘油三酯活性的药物和食物产品，而没有副作用且易于长时间摄取。3发明公开本发明的目标是提供一种用于治疗和预防例如动脉硬化的疾病的脂质代谢改善剂。本发明提供了一种脂质代谢改善剂，包含作为活性成分的杆菌属(genus/h"7/w5)细菌的细胞或培养物。本发明也提供了一种降低血清甘油三酯剂，包含作为活性成分的杆菌属细菌的细胞或培养物。属于杆菌属细菌优选枯草杆菌(5flcz7/附w磁s)，更优选枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)。附图简述图1显示来自枯草杆菌C-3102的基因组DNA的限制性内切酶Notl或Sfil的消^匕图"i普。图2显示摄取本发明的脂质代谢改善剂的受试者的血清甘油三酯浓度随时间的改变。优选的实施方式杆菌属细菌(例如，枯草杆菌)，已经长期与人的饮食习惯密切相关。尽管已存在关于该生物体的功能性的丰富的信息，以前没有报道它具有降低血清甘油三酯的作用或脂质代谢改善效应。本发明的脂质代谢改善剂和降低血清甘油三酯剂的特征在于，含有作为活性成分的杆菌属细菌的细胞或培养物，优选枯草杆菌的细胞或培养物。枯草杆菌的细菌学特征如5ergey\Afow認/5acten'o/ogy,11巻(1986)描述，且包括以下(1)革兰氏阳性(2)形成卵形孢子(3)杆状的(4)能动的(5)需氧的(6)过氧化氢酶阳性(7)在50°C的生长+(8)在pH5.7的生长+(9)利用枸橼酸盐+(10)从阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇的糖的产酸作用+(11)VP反应+(12)淀粉水解作用+-(13)硝酸还原作用+(14)吲哚的产生-(15)明胶水解:+(16)酪蛋白的水解作用+(n)在液体培养基中成膜+(18)牛奶的乳凝—(19)牛奶胨化+用于本发明的脂质代谢改善剂和降低血清甘油三酯剂的枯草杆菌可能包括，例如，枯草杆菌C-3102(1985年12月25日保存于日本国家生物科学和人类才支术研究所(Japan'sNationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology)，入藏登记号为ERMBP-1096)。枯草杆菌C-3102的大豆培养物对于家畜具有许多理想的效应，例如，改进肠内菌丛、身体生长，防止感染，增加蛋壳硬度，提高肉质并改善粪臭，并可用作飼料添加剂(日本专利公开号H4-24022)。该菌抹对于人类健康的有益效应包括调节肠道功能，和减少肠道腐败产物(C7zo朋z'&汰&Ca欣a^/w'(JournalofIntestinalMicrobiology)Vol.18,No.2,93-99(2004))。用枯草杆菌C-3102,使用下面的SEQIDNOs:l和2的PCR引物，通过PCR扩增一个大约700bps片段。在其它枯草杆菌菌林中，用这些PCR引物没有观察到扩增。用枯草杆菌C-3102作为模板，扩增大约700bps片段，与淀粉酶序列没有同源性。这清楚地区别了C-3102菌株和其它枯草杆菌菌抹。序列1:5，-GCCCCGCACATACGAAAAGACTGGCTGAAA-3，(SEQIDNO:1)5序列2:5，-GGATCCCACGTTGTGATTAAAAGCAGCGAT-3，(SEQIDNO:2)枯草杆菌C-3102也具有以下特征(1)缺乏质粒DNA。(2)从用限制性内切酶NotI或SfiI消化的基因组DNA获得的消化图谱,和通过琼脂糖电泳分离如图1所示。(3)产生对于及ceraws的抗菌物质。(4)缺乏对于氨节西林、氯霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平、链霉素、四环素、甲氧千啶和万古霉素(每种情况下，最小抑制浓度为0.03-4jLig/mL)的耐药性。枯草杆菌可以使用通常用来生长微生物的液体或固体培养基来培养，其含有，例如，碳源、氮源和无机物。碳源可以是枯草杆菌能够利用的任一碳源，例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉或糖蜜。可以使用的氮源的例子包括蛋白胨、酪蛋白水解物、肉浸膏和硫酸铵。另外，如果需要，可以加入磷酸及其盐，例如，钾盐、镁盐、钙盐、钠盐、铁盐和锰盐，还有维生素类、氨基酸类和表面活性剂。除了这样的人工培养基，也可以使用源自天然产物的物质来培养枯草杆菌，例如，大豆油粕粉。培养优选在需氧条件下进行。培养装置的优选的例子包括对于具有发酵罐的充气转转器液体培养的装置、托盘型固体培养装置和自动制造日本酒曲的培养装置。培养温度优选20-50。C,更优选30-45。C;培养期为12小时-7天；初始pH优选5-9，更优选6-8。因此获得的培养物包含枯草杆菌细胞、培养基和发酵产物。可以无需处理直接使用培养物作为脂质代谢改善剂或降低血清甘油三酯剂。或者，可以浓缩并使用培养物。可以向培养物或浓缩的培养物中加入赋形剂和其它成分，作为制备干燥粉末、粒剂或片剂来使用。从培养物分离的细胞、不含细胞的培养物或含有细胞的培养物，可以用于本发明。在一种特别优选的实施方式中，使用适于用作食物的天然来源的物质来培养枯草杆菌，例如，大豆油粕粉、煮熟的大豆、煮熟的赤豆、煮熟的大6米、与大麦一起煮熟的大米、麦麸、煮熟的玉米和其它谷物，且将枯草杆菌直接混入食品中无需从培养物中分离细胞。本发明的脂质代谢改善剂和降低血清甘油三酯剂，可以采取以下形式，例如，液体、粉末、粒剂或片剂，或可以作为食物添加剂混合到饮料和食品中并被摄入。饮料和食品的示例性的例子包括饮料、蜜饯和糖果、膏剂、面包、加工的鱼和肉制品，及乳制品。本发明的脂质代谢改善剂和降低血清甘油三酯剂，可以添加到这些各种食物原料中，并作为具有促进健康益处的健康饮料、健康食物或营养制品(nutraceuticals)来供给。如上所述，本发明提供了具有降低血清甘油三酯活性的脂质代谢改善剂，其包含作为活性成分的枯草杆菌的细胞或其培养物。本发明的作为活性成分的枯草杆菌，以非常小的量和在短时间内是有效的。它具有非常好的保存性和耐酸性，易于到达大肠内且易于在大肠内生长，且预期具有持续的降低血清甘油三酯效应。本文在本说明书中引入所有专利和参考文献的完整内容，作为参考。另外，作为本发明的优先权基础的日本专利申请2006-224672的说明书和附图的完整内容由于提及而引入本文。下面通过工作实施例更详细地描述了本发明，尽管没有通过实施例限制本发明的范围。实施例1在下面的工作实施例中，枯草杆菌C-3102(1985年12月25日保存于日本国家生物科学和人类技术研究所，入藏登记号为ERMBP-1096)作为杆菌属的细菌的例子使用。向5千克粒状的商购的大豆油粕粉加入5千克自来水，并将此混合物在121。C灭菌120分钟，然后用已经预培养过的枯草杆菌菌林C-3102的培养肉汤接种。产生的混合物在37。C培养40小时，以产生枯草杆菌C-3102的大豆培养物。将产生的培养物干磨，与如下表所示的其它成分混合，并制备500mg片剂(每个含有3><109枯草杆菌孢子)。表1-l显7示片剂中含有的营养物，表l-2显示片剂的组成。表1片剂的营养物分析(每100g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2血清甘油三酯升高抑制试验(人类摄入测试)步骤选择10名年龄为25-40岁的健康男性和女性(5名女性和5名男性)作为受试者。选择标准如表2所示。服用或摄取用于特定健康用途的特定药物或食物的个体除外。表2选择满足以下标准且没有符合排除标准的IO个个体(5名女性和5名男性)作为受试者。__选4奪标准(选择受试者的标准)__(1)年龄为25-40岁的个体。-_(2)没有服用任何药物且没有明显疾病的个体(TG、T-cho、BS、血压、便秘、等等)。_:a)中性脂肪<250mg/dL。_:b)总胆固醇<240mg/dL。_;c)空腹血糖<126mg/dL。_d)GOT<50IU/L;GPT<50IU/L;y-GTP<100IU/L。_e)收缩压<140mmHg;舒张压<90mmHg。_1(3)具有相对稳定的饮食和运动水平的个体。_;(4)接受医学设备的常规检查的个体。_|(5)没有显示对于摄入所研究的食物(豆豉培养物)的过敏反I应的个体。__(6)能够限制其酒精饮料摄入的个体(每天不超过相当于500mL啤酒的量)。___(7)在测试过程中能够保持恒定的日常生活方式的个体。;(8)在整个测试期间中能够记日记(以记录对于所研究的药物的摄入、运动、饮食和体重)的个体。_(9)在开始测试前，已经同意参与测试且已经签署知情同意书并登记日期的个体。只要有可能，受试者每日早饭后口服摄入一个500mg片剂(一个枯草杆菌C-3102的大豆培养物片剂含有3xl(f枯草杆菌孢子)，进行4周的时期。在开始摄入前和开始摄入的1周后、2周后、3周后和4周后收集禁食雪样(在前一晚9点后没有进食或饮水；在早晨固定时间点取血)，并测量每个样品的血清甘油三酯水平。测试时间表如表3所示。表3测试时间表(测试项目/时期)摄入时期(4周)测试项目/时期(周)开始1周2周3周4周在9月在9月在10在10在1022曰29曰月6曰月13月20左右左右左右曰左右曰左右体重指数+心血管4企查身高(初始检查)、体重、身体脂00000肪百分比(BI方法)、血压、脉搏、体温血液生物化学(1)TG、T-cho、AG比例、总胆红素、空腹血糖、G〔)T、GPT、AL-P、y-GTP、00000淀粉酶、LDL-cho、HDL-cho、LDH、总蛋白质、白蛋白、UA、BUN、肌酐、ZTT、Na、Cl、K、Ca、离子4丐、P、Mg、Fe血液生物化学(2)pt(凝血酶原)、肝促凝血酶原激00000(hepapiasfin)、HbAc、TT(凝^试验〕、纤维蛋白原(fibrinogen)、apttn足凝血酶原激酶时间)、维生素K部分常规血液;险验WBC、RBC、Hb、Ht、MCV、MCH、00000mchc、血小板常规尿检-验糖、蛋白质、尿胆素原00000(urobilinogen)、沉淀(当蛋白质阳性时，进行)医生对患者会诊检查主观症状和不利事件，核对日记和提供的指导000000:已经冲企查的10以上测试的结果如图2所示。在开始摄入时，血清甘油三酯水平为103.6±42.82mg/dL;在摄入l周后，血清甘油三酯水平为69.8±32.00mg/dL;在摄入2周后，血清甘油三酯水平为63.0±24.58mg/dL;在摄入3周后，血清甘油三酯水平为77.0±35.63mg/dL;和在摄入4周后，血清甘油三酯水平为71.8±37.26mg/dL。根据摄入时期的重复测量的变异的单向(one-way)分析显示显著性差异(p<0.01)。作为多重比较的结果(Tukey-Kramer测试)，在开始摄入时和摄入1周后之间观察到显著性差异(p<0.05)，在开始摄入时和摄入2周后之间观察到显著性差异(p<0.05),在开始摄入时和摄入4周后之间观察到显著性差异(p<0.05)。根据以上结果，可以明显看出枯草杆菌C-3102的大豆培养物具有降低血清甘油三酯的效应。工业实用性本发明的脂质代谢改善剂能够降低人类血清甘油三酯浓度，因而可作为预防和改善动力永石更化的药物使用。ii权利要求1.一种包含作为活性成分的属于杆菌属的细菌的培养物的脂质代谢改善剂。2.如权利要求1所述的脂质代谢改善剂，其中，所述属于杆菌属的细菌为枯草杆菌。3.如权利要求1或2所述的脂质代谢改善剂，其中，所述属于杆菌属的细菌为枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)。4.一种包含作为活性成分的属于杆菌属的细菌的培养物的降低血清甘油三酯剂。5.如权利要求4所述的降低血清甘油三酯剂，其中，所述属于杆菌属的细菌为枯草杆菌。6.如权利要求4或5所述的降低血清甘油三酯剂，其中，所述属于杆菌属的细菌为枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)。7.—种包含作为活性成分的属于杆菌属的细菌的脂质代谢改善剂。8.—种包含作为活性成分的属于枯草杆菌的细菌的脂质代谢改善剂。9.一种包含作为活性成分的枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)的脂质代谢改善剂。10.—种包含作为活性成分的属于杆菌属的细菌的降低血清甘油三酯剂。11.一种包含作为活性成分的属于枯草杆菌的细菌的降低血清甘油三酯剂。12.—种包含作为活性成分的枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)的降低血清甘油三酯剂。全文摘要[问题]为了提供没有副作用、可以持续摄入且具有降低血清甘油三酯的活性的药物和食品。[解决问题的方法]一种改善脂质代谢的药物和一种降低血清甘油三酯的药物，每个含有作为活性成分的属于杆菌属的细菌的培养物。细菌优选枯草杆菌，更优选枯草杆菌C-3102(FERMBP-1096)。改善脂质代谢的药物和降低血清甘油三酯的药物可用于治疗和预防例如动脉硬化的疾病。文档编号A61P9/10GK101511377SQ20078003125公开日2009年8月19日申请日期2007年8月14日优先权日2006年8月21日发明者藤原茂,铃木宏美申请人:卡尔皮斯株式会社