一种水体中痕量类固醇的快速检测装置的制作方法

本实用新型属于分析检测技术领域，具体涉及一种水体中痕量类固醇的快速检测装置。

背景技术：

类固醇又称甾体，是脂类的一种，它具有极强的内分泌干扰性和生物活性，在极低浓度下便能引起人体生殖障碍、行为异常、内分泌紊乱甚至癌症等。环境中的类固醇主要来源于人及脊椎动物的排泄、人工合成类固醇药物的使用及医院、制药企业的废水排放。由于污水处理厂对类固醇物质不能完全清除，残存的类固醇将会被排入环境水体中。研究发现，水体中的类固醇生态环境效应最为直接，存在于水体中的类固醇物质不仅在极低浓度下就能给水生生物造成性别干扰，同时人类饮用这些水体和食用经水体污染的生物也会引起各种疾病。因而对水体中残留的类固醇的准确测定是进行风险评估和污染防治的重要手段，也是保证环境安全和食品安全的基础。

近年来，类固醇检测方面的研究受到越来越多的关注，随着科技的发展以及人们对食品和环境安全的普遍关心，检测方法灵敏度方面的要求也越来越高。检测类固醇通常使用的分析方法有高效液相色谱法（High performance liquid chromatography, HPLC）、液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography-mass spectrum, LC-MS）和气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrum, GC-MS），但是这些方法分析时间较长且消耗试剂量大，不能满足现代检测方法快速、准确的要求。因此一些快速质谱分析方法应运而生，经常使用的离子化方法有电喷雾电离（Electrospray ionization, ESI）、大气压化学电离（Atmospheric pressure chemical ionization, APCI）和基质辅助激光解析电离（Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）等，但是，这些电离源需要对待测样品进行至少两步的样品预处理，将不同物质形态的样品转化成为分析样品，操作较为繁复。在二十一世纪初，出现了可用于复杂样品直接快速分析的解吸电喷雾电离（Desorption electrospray ionization, DESI）质谱分析方法，然而这一方法对于所测物质存在明显的极性歧视，一些弱极性和非极性的物质电离效率很低，由于类固醇是一类四环脂肪烃化合物，多为极性很弱的物质，使用上述分析方法较难检测。除此之外，介质阻挡放电电离（Dielectric barrier discharge ionization, DBDI）作为一种软电离源因其温度低和电离温和的特点，适合非热稳定性以及弱极性和非极性物质的电离。2014年Subhrakanti Saha等将莱顿弗洛斯特效应（Leidenfrost phenomenon）与DBDI结合起来高灵敏度地检测出了类固醇物质。当液体滴在一块远超其沸点的物体上时，在液滴和热烫表面之间会形成一层蒸汽，由于蒸汽的传热比液体慢得多，这层蒸汽一定程度上起到了隔热的作用使液体蒸发的速度大大减慢，这种现象被称为莱顿弗洛斯特效应。Subhrakanti Saha等利用这种现象使样品溶剂缓慢蒸发后再释放出待测物分子，与较低温度下的热解析方法相比提高了分析的灵敏度。然而这一方法使用的电离方式是介质阻挡放电电离，样品分子在电离过程中会产生碎片离子，当测试成分复杂的环境水体基质样品时，易造成定量结果不准确，同时重复性和灵敏度也会降低。而且，这一方法在测试之前需要经过萃取这一样品预处理步骤，将待测样品富集纯化后才能获得较低的检测限和较好的回收率，仍然不能满足现代分析方法对痕量待测样品准确、灵敏和高通量的检测要求。除此之外，介质阻挡放电电离离子源需要使用高压电源来产生等离子体，且需要氦气做载气，装置的功耗很高，体积较大，且耗材昂贵。

技术实现要素：

为了解决定量准确性低，重复性差，灵敏度不够，检测限偏高，待测样品必须预处理，样品消耗体积大，装置耗材昂贵功耗高等问题，本实用新型提供了一种水体中痕量类固醇的快速检测装置。

一种水体中痕量类固醇的快速检测装置包括质谱仪和电离机构，还包括样品处理机构。

所述样品处理机构包括挥发溶剂引入机构、加热传输机构和蒸发富集喷射机构，所述蒸发富集喷射机构的锥形喷嘴15对应着所述质谱仪的质谱入口21；所述锥形喷嘴15和质谱入口21之间的上方为电离区域，所述质谱入口的上方设有电离源；与所述电离源的出光孔对应处设有第三载气管17，第三载气管17上设有第三流量计18；

所述挥发溶剂引入机构包括挥发溶剂储罐5，挥发溶剂储罐5的一侧设有第一载气管2，第一载气管2的一端伸入挥发溶剂储罐5内底部，第一载气管2另一端位于挥发溶剂储罐5的外部，第一载气管2的外伸端上设有第一流量计3；

所述加热传输机构包括主管10和加热套管12；所述主管10的一端为L形的进口端，主管10的另一端为出口端，主管10中部一侧连通着第二载气管8；所述第二载气管8上设有第二流量计9；主管10的进口端由挥发溶剂储罐5的顶部伸入挥发溶剂储罐5内，所述加热套管12套设在出口端一侧的主管10上；

所述蒸发富集喷射机构包括管状的本体，本体的一端为导管13，本体的另一端为锥形喷嘴15，本体的中部为蒸发腔14；所述蒸发腔14内一侧径向设有样品槽141，与样品槽141同轴对应的蒸发腔14另一侧开设有进样孔142，进样孔142处设盖子16；所述蒸发富集喷射机构的导管13连通着主管10的出口端；

工作时，通入的第一载气1与挥发溶剂4混合形成第一混合气6，再与通入的第二载气7汇合形成第二混合气11；待蒸发腔14的温度达到被测溶液的莱顿弗洛斯特效应点，将被测溶液加入蒸发腔14的样品槽141，被测溶液在第二混合气11和第三载气19作用下产生莱顿弗洛斯特效应，并通过锥形喷嘴喷15入电离区域；类固醇分子被电离成类固醇离子；并被吸入质谱仪，经质谱仪检测获得类固醇被测物的质谱图和选择离子流图；

工作时处于正离子模式，质谱入口21上施加-0.5～-6 kV的电压，流经质谱仪进样管23外部的干燥气体22的流速为1～10 L/min，温度为100～400 ℃；挥发溶剂储罐5内的挥发溶剂4为甲苯；第一载气管2内通入第一载气1，第二载气管8内通入的第二载气7，第三载气管17通入第三载气19，所述第一载气1、第二载气7和第三载气19均为氮气；第一载气1内的氮气流速为20~100 ml/min，第二载气7内的氮气流速为100~500 ml/min，第三载气19内的氮气流速为50~400 ml/min。

进一步限定的技术方案如下：

所述质谱仪为飞行时间质谱或四级杆质谱等质谱仪。

所述电离源为真空紫外放电灯20。

所述主管10的内径为10～15 mm；所述锥形喷嘴15与质谱入口21同轴，锥形喷嘴15和质谱入口21在水平方向之间的距离为15～20 mm。

所述真空紫外放电灯20的出光孔垂直于质谱入口21，所述出光孔和质谱入口21在水平方向之间的距离为5～10 mm、在垂直方向上的距离为2～8 mm。

所述导管13的内径为6～8 mm，外径与主管10的内径相同。

所述蒸发腔14内的样品槽141为深4 mm的半球形凹槽，进样孔142的直径为4～7 mm。

所述锥形喷嘴15的喷口处设有外伸的管状喷口，管状喷口的内径为2 mm，长度为3～8 mm。

所述第一流量计3、第二流量计9和第三流量计18均为浮子流量计。

本实用新型的有益技术效果体现在以下方面：

1.采用的大气压光电离离子源对于类固醇物质电离效率较高、无需样品预处理操作、适合各种自然水体中类固醇物质的检测。常用于分析类固醇物质的大气压质谱分析方法如：电喷雾电离（Electro spray ionization, ESI）和解吸电喷雾电离（Desorption electrospray ionization, DESI）等对于所测物质存在明显的极性歧视，对一些弱极性和非极性的物质电离效率很低；类固醇分子中含有羟基或者羰基，极性较弱，使用上述方法电离效果较差；大气压光电离源是一种软电离源，无极性歧视，相对而言更容易检测分析类固醇类物质。大气压光电离作为一种敞开式离子源相对于电喷雾电离（Electrospray ionization, ESI）和大气压化学电离（Atmospheric pressure chemical ionization, APCI）而言对样品基质的容忍度更高，受到基质中盐类的干扰更小，对于水体基质而言无需预处理操作即可得到较好的测试结果，因而本装置更适用于各种自然水体基质，例如河水、地表水、生活用水、工业废水等。

2.本装置定性和定量准确，稳定性好。本装置采用的大气压光电离源电离能量较低，是一种温和的电离源，这一电离源通过发射10.6 eV的光子将待测物分子电离为分子离子，几乎不产生碎片离子，提高了质谱定性和定量的准确性和稳定性；本装置连续测试五次浓度为100 pg/ml的甲睾酮时计算得到的相对标准偏差仅为8.14 %，三天之内测试浓度为50ng/ml的甲睾酮得到的相对标准偏差仅为3.98 %，说明本装置的稳定性和重复性均很好；本装置测试甲睾酮时定量范围可以达到3个量级，从100 pg/ml 到 250 ng/ml 的浓度范围内均能对甲睾酮进行准确定量，满足了环境水体常规测试的定量要求。

3.本装置灵敏度高，检测限低，样品消耗量小。本装置在测试时利用了莱顿弗洛斯特效应，当液滴滴在一块温度远超其沸点的金属表面时，在液滴和热烫表面之间会形成一层蒸汽，由于蒸汽的传热比液体慢得多，这层蒸汽一定程度上起到了隔热的作用，液滴不再迅速沸腾而是缓慢蒸发，这种现象叫做莱顿弗洛斯特效应，可以使这种物理现象发生的金属表面温度叫做莱顿弗洛斯特效应点（Leidenfrost temperature ）；本装置中的样品蒸发富集机构整体均为不锈钢金属材料，且温度保持在测试溶液的莱顿弗洛斯特效应点，测试时液滴被滴在样品蒸发富集机构的样品槽141上，液滴在样品槽141上缓慢蒸发，类固醇分子在液滴溶剂完全蒸发的瞬间被立即释放，在这个过程中类固醇分子被有效的富集浓缩；样品蒸发富集机构中的锥形喷嘴15被设计为漏斗状，当类固醇分子由样品蒸发富集机构喷射向电离区域的时候分子分布更加集中；蒸发腔14的样品槽141和盖子16在测试过程中可以有效避免类固醇分子的逸失，以上样品蒸发富集机构结构的设计均提高了装置测试的灵敏度，本装置对于黄体酮分子的检测限仅有10 pg/mL，相对于LC-APCI-MS/MS方法（黄体酮分子的检测限6 ng/mL）而言灵敏度提高了3个量级；灵敏度的提高可以满足痕量样品的分析检测，打破了对样品测试体积的限制，由于本装置特殊的样品蒸发富集机构结构，实验时只需一滴溶液即可完成测试，测试体积只有2- 10 μL，相对于DBDI-MS/MS方法中测试体积50 μL而言样品消耗量更小。

4.本装置结构简单，耗材便宜，功耗小。本装置使用的载气均为氮气，相比于DBDI-MS/MS方法使用的氦气和氩气等而言相对低廉易得；除质谱仪外，本方法使用的加热套12和真空紫外放电灯20这两个零件的功耗都很小。

附图说明

图1为本实用新型结构示意图。

图2（a）为样品蒸发富集喷射机构的结构示意图。

图2（b）为样品蒸发富集喷射机构的剖视图。

图3为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试河水样品获得的质谱图。

图4为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试河水中的甲睾酮时获得的选择离子流图。

图5为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试甲睾酮标准溶液获得的标准曲线图。

图6为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试地表水样品获得的质谱图。

图7为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试地表水中的黄体酮时获得的选择离子流图。

图8为本实用新型在质谱仪正离子模式下测试黄体酮标准溶液获得的标准曲线图。

上图中序号：第一载气1、第一载气管2、第一流量计3、挥发溶剂4、挥发溶剂储罐5、第一混合气6、第二载气7、第二载气管8、第二流量计9、主管10、第二混合气11、加热套12、导管13、蒸发腔14、锥形喷嘴15、盖子16、第三载气管17、第三流量计18、第三载气19、真空紫外放电灯20、质谱入口21、干燥气体22、质谱仪进样管23。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本实用新型作进一步地描述。

实施例1

参见图1，一种水体中痕量类固醇的快速检测装置包括质谱仪、电离机构和样品处理机构，质谱仪为飞行时间质谱。

样品处理机构包括挥发溶剂引入机构、加热传输机构和蒸发富集喷射机构，所述蒸发富集喷射机构的锥形喷嘴15的喷口处设有外伸的管状喷口，管状喷口的内径为2 mm，长度为6 mm。所述蒸发富集喷射机构的锥形喷嘴15与质谱仪的质谱入口21同轴，锥形喷嘴15和质谱入口21在水平方向之间的距离为18 mm。所述蒸发富集喷射机构的锥形喷嘴15和质谱仪的质谱入口21之间的上方为电离区域，所述质谱入口21的上方安装有电离源，电离源为真空紫外放电灯20。与真空紫外放电灯20的出光孔对应处安装有第三载气管17，第三载气管17上安装有第三流量计18。真空紫外放电灯20的出光孔垂直于质谱入口21，出光孔和质谱入口21在水平方向之间的距离为7 mm、在垂直方向上的距离为5 mm。

挥发溶剂引入机构包括挥发溶剂储罐5，挥发溶剂储罐5的一侧安装有第一载气管2，第一载气管2的一端伸入挥发溶剂储罐5内底部，第一载气管2另一端位于挥发溶剂储罐5的外部，第一载气管2的外伸端上安装有第一流量计3。

加热传输机构包括主管10和加热套管12。主管10的内径为12 mm，主管10的一端为L形的进口端，主管10的另一端为出口端，主管10中部一侧连通着第二载气管8；第二载气管8上安装有第二流量计9；主管10的进口端由挥发溶剂储罐5的顶部伸入挥发溶剂储罐5内，加热套管12套装在出口端一侧的主管10上。

第一流量计3、第二流量计9和第三流量计18均为浮子流量计。

参见图2（a）和图2（b），蒸发富集喷射机构包括管状的本体，本体的一端为导管13，导管13的内径为7 mm，外径与主管10的内径相同；本体的另一端为锥形喷嘴15，本体的中部为蒸发腔14。蒸发腔14内一侧径向设有样品槽141，与样品槽141同轴对应的蒸发腔14另一侧开设有进样孔142，进样孔142处安装有盖子16。蒸发腔14内的样品槽141为深4 mm的半球形凹槽，进样孔142的直径为6 mm；蒸发富集喷射机构的导管13连通着主管10的出口端。

本实用新型的工作原理说明如下：

由第一载气管2通入第一载气1，挥发溶剂4通过鼓泡法由液态转化成气态，并在挥发溶剂储罐5内混合，得到第一混合气6；再与第二载气管8通入的第二载气7汇合得到第二混合气11；由第三载气管17通入第三载气19；待蒸发腔14的温度达到测试溶液的莱顿弗洛斯特效应点后，将含有类固醇分子的测试溶液通过进样孔142放入蒸发腔14的样品槽141内，并在进样孔142处盖上盖子16；测试溶液在混合气11的吹扫下，在样品槽141内产生莱顿弗洛斯特效应，溶剂缓慢蒸发，在溶剂完全蒸发的瞬间，类固醇分子被立即释放，通过蒸发富集喷射机构的锥形喷嘴15喷出到达电离区域；类固醇分子吸收电离区域的真空紫外放电灯20发射出的光子的能量被电离成类固醇离子；类固醇离子飘散到质谱分析区域后立即被质谱仪进样管23吸入质谱仪内，经质谱仪检测后获得类固醇分子的质谱图和选择离子流图。

工作时处于正离子模式，质谱入口21上施加-3.5 kV的电压，流经质谱仪进样管23外部的干燥气体22的流速为5 L/min，温度为325 ℃；挥发溶剂储罐5内的挥发溶剂4为甲苯；第一载气管2内通入第一载气1，第二载气管8内通入的第二载气7，第三载气管17通入第三载气19，所述第一载气1、第二载气7和第三载气19均为氮气；第一载气1内的氮气流速为40 ml/min，第二载气7内的氮气流速为350 ml/min，第三载气19内的氮气流速为100 ml/min。

下面将本装置应用于河水中甲睾酮的检测。

首先配制系列标准溶液。准确称取甲睾酮100 mg，放入10 ml容量瓶内，使用甲醇溶解并定容，获得甲睾酮浓度为10 mg/ml的母液1；使用甲醇对母液1梯度稀释，获得甲睾酮浓度依次为2.5 mg/ml、1 mg/ml、500 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、10 ng/ml和1 ng/ml的母液2；准确称取醋酸甲羟孕酮5 mg，放入10 ml容量瓶内，使用甲醇溶解并定容，获得醋酸甲羟孕酮浓度为500 ng/ml的内标1；使用甲醇对内标1稀释10倍，获得醋酸甲羟孕酮浓度为50 ng/ml的内标2；按照母液2：内标2：去离子水：甲醇=1:1:1:7的体积比配制甲睾酮浓度依次为250 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml和100 pg/ml的系列标准溶液。

按照上述参数设置装置，待装置已达到实验条件后，使用上述系列标准溶液制作标准曲线，此时的系列标准溶液即为测试溶液。按照浓度从低到高的顺序依次分别测试系列标准溶液，使用量程为20 μl的移液枪吸取测试溶液10 μl，滴入蒸发腔14内，并及时合上盖子16，立即采谱，1 min后结束采谱；以质谱仪采集到的图 4甲睾酮的选择离子流图中的峰积分面积为定量依据，以测试溶液的浓度为X轴，以甲睾酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积之比为Y轴，建立如图 5 所示的标准曲线，拟合标准曲线得到线性回归方程为y=0.066x+0.104，相关性系数R²为0.99784，动态范围为0.1~250 ng/ml。

下面处理河水样品，使用甲睾酮浓度为100 ng/ml的母液2配制测试溶液，按照母液2：内标2：河水：甲醇=1:1:1:7的体积比稀释母液2，获得甲睾酮理论浓度为10 ng/ml的河水溶液，此时的河水溶液即为下一步测试的测试溶液。

待装置已达到实验条件后，使用量程为20 μl的移液枪吸取测试溶液10 μl，直接滴入蒸发腔14内，并及时合上盖子16，立即采谱，1 min后结束采谱，获得了图 3河水样品质谱图，准确测试出了甲睾酮（m/z 303.2319）。并且获得了甲睾酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积，将测试得到的甲睾酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积之比代入上述标准曲线的线性回归方程中，计算得出测试得到的甲睾酮浓度为10.577 ng/ml，回收率为105.77 %。

实施例2

装置搭建和工作原理同实施例1。

装置中不同的结构数据和工艺数据说明如下：

主管10的内径为10 mm；所述锥形喷嘴15与质谱入口21同轴，锥形喷嘴15和质谱入口21在水平方向之间的距离为15 mm。

真空紫外放电灯20的出光孔垂直于质谱入口21，所述出光孔和质谱入口21在水平方向之间的距离为8、在垂直方向上的距离为6。

导管13的内径为6 mm，外径与主管10的内径相同。

蒸发腔14内的样品槽141为深4 mm的半球形凹槽，进样孔142的直径为4 mm。

锥形喷嘴15的喷口处设有外伸的管状喷口，管状喷口的内径为2 mm，长度为3 mm。

工作于正离子模式时，质谱入口21上施加-3 kV的电压，流经质谱仪进样管23外部的干燥气体22的流速为3 L/min，温度为350 ℃；挥发溶剂储罐5内的挥发溶剂4为甲苯；第一载气管2内通入第一载气1，第二载气管8内通入的第二载气7，第三载气管17通入第三载气19，所述第一载气1、第二载气7和第三载气19均为氮气；第一载气1内的氮气流速为60 mL/min，第二载气7内的氮气流速为330 mL/min，第三载气19内的氮气流速为200 mL/min。

下面将本实施例装置应用于地表水中黄体酮的检测。

首先配制系列标准溶液。准确称取黄体酮100 mg，放入10 ml容量瓶内，使用甲醇溶解并定容，获得黄体酮浓度为10 mg/ml的母液1；使用甲醇对母液1梯度稀释，获得黄体酮浓度依次为5 mg/ml、2.5 mg/ml、1 mg/ml、500 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、10 ng/ml和1 ng/ml的母液2；准确称取醋酸甲羟孕酮5 mg，放入10 ml容量瓶内，使用甲醇溶解并定容，获得醋酸甲羟孕酮浓度为500 ng/ml的内标1；使用甲醇对内标1稀释10倍，获得醋酸甲羟孕酮浓度为50 ng/ml的内标2；按照母液2：内标2：去离子水：甲醇=1:1:1:7的体积比分别处理已得到的母液2，获得黄体酮浓度依次为500 ng/ml、250 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml和100 pg/ml的系列标准溶液。

按照上述参数设置装置，待装置已达到实验条件后，使用上述系列标准溶液制作标准曲线，此时的系列标准溶液即为测试溶液。按照浓度从低到高的顺序依次分别测试系列标准溶液，使用量程为20 μl的移液枪吸取测试溶液10 μl，直接滴入蒸发腔14内，并及时合上盖子16，立即采谱，1 min后结束采谱；以质谱仪采集到的图 7中的峰积分面积为定量依据，以测试溶液的浓度为X轴，以黄体酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积之比为Y轴，建立如图 8 所示的标准曲线，拟合标准曲线得到线性回归方程为y=0.074x+0.034，相关性系数R²为0.99890，动态范围为0.1~500 ng/ml。

下面处理地表水样品，使用黄体酮浓度为100 ng/ml的母液2配制测试溶液，按照母液2：内标2：地表水：甲醇=1:1:1:7的体积比稀释母液2，获得黄体酮理论浓度为10 ng/ml的地表水溶液，此时的地表水溶液即为下一步测试的测试溶液。

待装置已达到实验条件后，使用量程为20 μl的移液枪吸取测试溶液10 μl，直接滴入蒸发腔14内，并及时合上盖子16，立即采谱，1 min后结束采谱，获得了图6 地表水样品质谱图，准确测试出了黄体酮（m/z 315.2319）。并且获得了黄体酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积，将测试得到的黄体酮与醋酸甲羟孕酮的选择离子流图峰面积之比代入上述标准曲线的线性回归方程中，计算得出测试得到的黄体酮浓度为10.661 ng/ml，回收率为106.61 %。