一种同时测定三种双酚类物质含量的方法与流程

本发明属于有害物质残留检测技术领域，具体是涉及一种能够同时准确检测食品或食品包装材料中三种双酚类物质含量的方法。

背景技术：

双酚a(bpa)是聚碳酸酯塑料和环氧涂层的原材料，在食品接触材料中被广泛应用。研究表明双酚a具有一定的内分泌干扰作用，对婴幼儿影响尤其明显，因此欧盟、日本、中国、美国对双酚a在食品接触材料中的使用进行了严格限制。目前，生产企业常用结构和性能与双酚a较为类似的双酚af(bpf)或四溴双酚a代替双酚a。但有研究表明，双酚af和四溴双酚a也同样具有一定程度的人体健康危害性。这些双酚类物质易通过包装容器和塑料薄膜迁移至食品或饮料中，对人体雌雄激素比例失调有不容忽视的影响。

分散液液微萃取是一种集采样、萃取和浓缩于一体的样品前处理技术。微量萃取剂在分散溶剂的作用下，在样品溶液中形成无数微小液滴，由于萃取剂用量少且与水相接触面积很大，可快速达到传质平衡，萃取几乎不受萃取时间的影响，具有操作简单、快速、费用低、对环境友好等优点，因而在食品样品前处理及分析中备受关注。目前以低共熔溶剂进行的液液微萃取的萃取剂主要为疏水性的，以脂肪酸制备的低共熔溶剂用于双酚a萃取已有报道，但普遍存在萃取范围窄、萃取效果差等问题。这是由于以脂肪酸制备的低共熔溶剂虽然与双酚a有相似的极性，但由于是微萃取，萃取剂用量低，如果混合不均匀，萃取效果难以保证，同时萃取重现性也较差。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种灵敏度高、重现性好，特别适用于对食品及食品包装材料中三种双酚类物质残留含量进行准确检测的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

一种同时测定三种双酚类物质含量的方法，其特征在于：取50份样品溶液，经水相微孔滤膜过滤后，加入0.5～2份萃取剂和0.5～2份乳化剂，涡旋1～2min形成均匀乳液，静置5～10min后，再加入盐酸0.5～2份，离心分相，取上层萃取相采用高效液相色谱同时测定双酚a、双酚af和四溴双酚a的含量；所述萃取剂的制备方法为：以正辛酸、正壬酸、正癸酸、十一烷酸和十二烷酸为原料，取其中的任意两种按摩尔比1～3：1混合，或是取其中的任意三种按摩尔比1～3：1：1混合，然后将二元或三元混合物加热至70～80℃，形成均匀透明的低共熔溶剂；所述的乳化剂为氨水或氢氧化钠中的一种。

所述的离心速度为3000～5000rpm，离心时间为5～10min。

本发明检测的样品可以是食品，或是食品的包装材料。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明以多种脂肪酸的混合物制备低共熔溶剂作为萃取剂，首创以碱为乳化剂，所形成的乳液中萃取目标物与萃取剂接触充分，萃取完全，再用盐酸作相分离剂，并结合高效液相色谱方法，能够同时准确检测三种低含量双酚类物质，包括双酚a、双酚af和四溴双酚a。

2、所采用的碱乳化剂及酸相分离剂，对后续的液相色谱检测无干扰。

3、本发明方法的最大优点在于乳液形成快，均匀，相分离迅速、完全，具有高效、低毒、操作简单、灵敏度高、重现性好等技术特点。特别适用于食品及食品包装材料中三种双酚类物质残留的定量分析。

附图说明

图1为实施例3分别加标0.50μg/kg双酚a、双酚af及四溴双酚a色谱对比图。a为经本发明微萃取处理，b未经本发明微萃取处理。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1：桶装水及水桶中双酚a含量检测

1、低共熔溶剂的制备：将正辛酸、正癸酸按摩尔比2：1混合，加热至70℃，形成均匀透明溶液，即形成低共熔溶剂。

2、工作曲线制作：分别配制0.1、0.5、1、2、5、10、20μg/ml的双酚a标准溶液，液相色谱条件：流动相为乙腈-水，v(乙腈):v(水)＝60:40，流量1ml/min，检测波长224nm，自动进样器进样，进样体积10μl。其线性范围、回归方程及相关系数见表1。

表1双酚类物质线性范围、回归方程、相关系数

表2双酚类物质加标回收率(％)n＝6

3、桶装水中双酚a测定：取50ml桶装水，经0.45μm水相微孔滤膜过滤，加入步骤(1)制备的低共熔溶剂0.5ml为萃取剂，0.5ml浓氨水为乳化剂，涡旋混合1min，形成均匀乳液，然后静置5min，加入浓盐酸1ml，3000rpm离心时间5min，进行相分离，取10μl上层萃取相进行高效液相色谱分析，代入回归方程含量计算，双酚a的含量为0.02μg/kg。

4、水桶双酚a测定：取桶装水塑料，超纯水冲洗后，晾干将其剪碎，精密称取1.000g样品置于烧杯中，加入10ml二氯甲烷，超声(功率120w；频率40khz)溶解并混匀，加入15ml甲醇，充分震荡摇匀，使高分子化合物沉淀，过滤，滤液在40℃水浴蒸干，用甲醇溶解残渣，转移至50ml容量瓶中，超纯水定容至刻度，0.45μm滤膜过滤，其他操作如步骤(3)。水桶材料中双酚a的平均含量为36.8μg/g。

实施例2：猪肉罐头中双酚a和双酚af含量的测定

1、低共熔溶剂的制备：将正壬酸、正癸酸、十一烷酸按摩尔比3：1：1混合，加热至75℃，形成均匀透明溶液，即形成低共熔溶剂。

2、工作曲线制作：分别配制0.1、0.5、1、2、5、10、20μg/ml双酚a和双酚af混合标准溶液，其线性范围、回归方程及相关系数见表1，加标回收率见表2。色谱条件：agilenteclipseplusc18色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)，柱温为30℃；流动相a为水，流动相b为甲醇，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：(0-3)min，50％b，(3-7)min，50％b-80％b，(7-15)min，80％b，(3-7)min，80％b-50％b；流速为1.0ml/min；检测波长：280nm；进样量为10μl。

3、猪肉罐头样品前处理：

(1)样品制备：称取100g猪肉罐头，经高速组织捣碎机充分匀浆。

(2)样品提取：称取(1.00土0.01)g样品于10ml离心管中，加入5ml乙腈，旋涡混匀器上混匀；超声30min，10000r/min离心5min，上清液转入多样品浓缩瓶中；再向离心管中加入10ml乙腈，旋涡振荡2min，离心10min，合并上清液45℃真空浓缩近干，用5.0ml乙腈溶解残渣，用高纯水定容至50ml制成待测样品溶液待用。同时做试剂空白实验。

(3)样品测定：取50ml上述待测样品溶液，经0.45μm水相微孔滤膜过滤，加入步骤(1)制备的低共熔溶剂1ml为萃取剂，0.5gnaoh为乳化剂，涡旋混合2min，形成均匀乳液，然后静置10min，加入浓盐酸1.5ml，4000rpm离心时间5min，进行相分离，取10μl上层萃取相进行高效液相色谱分析，代入回归方程计算，猪肉罐头中双酚a的平均含量为2.8μg/kg，双酚af未检出。

实施例3：塑料包装材料中双酚类物质的测定

1、低共熔溶剂的制备：将正壬酸、十一烷酸、十二烷酸按摩尔比2：1：1混合，加热至80℃，形成均匀透明溶液，即形成低共熔溶剂。

2、工作曲线制作：分别配制0.1、0.5、1、2、5、10、20μg/ml双酚a、双酚af、四溴双酚a混合标准溶液，其线性范围、回归方程及相关系数见表1，加标回收率见表2，加标0.50μg/kg双酚a、双酚af及四溴双酚a经本发明微萃取处理和未经微萃取处理色谱图见图1，色谱条件同实施例2。

3、塑料包装材料中双酚类物质样品前处理：将塑料包装材料样品粉碎，研磨过74μm(200目)筛子后，准确称取1g样品(精确至0.1mg)置于50ml离心管中，加入10ml甲醇，振荡混匀后，于40℃下超声萃取20min，以10000r/min离心5min，取出上清液，再加入10ml甲醇，重复提取1次，合并2次提取液，氮吹至近干，用1.0ml流动相溶解后，用高纯水定容至50ml制成待测样品溶液待用。同时做试剂空白实验。

4、样品测定：取50ml上述待测样品溶液，经0.45μm水相微孔滤膜过滤，加入步骤(1)制备的低共熔溶剂2ml为萃取剂，1gnaoh为乳化剂，涡旋混合2min，形成均匀乳液，然后静置10min，加入浓盐酸2ml，3500rpm离心时间5min，进行相分离，取10μl上层萃取相进行高效液相色谱分析，代入回归方程计算，塑料包装材料中双酚a的平均含量为12.6μg/kg，双酚af平均含量为2.1μg/kg、四溴双酚a5.1μg/kg。

实施例4：袋装牛奶中的双酚a的测定

1、低共熔溶剂的制备：将正辛酸、十一烷酸按摩尔比2：1混合，加热至80℃，形成均匀透明溶液，即形成低共熔溶剂。

2、工作曲线制作：同实施例1。

3、样品制备：取5ml牛奶样品，加入20ml甲醇后均质1min，40℃水浴振荡30min，将混合液转入玻璃离心管后3500rpm离心时间5min，取上清液经0.45μm水相微孔滤膜过滤，用高纯水定容至50ml制成待测样品溶液待用。同时做试剂空白实验。

4、样品测定：取50ml上述待测样品溶液，经0.45μm水相微孔滤膜过滤，加入步骤(1)制备的低共熔溶剂1ml为萃取剂，1ml浓氨水为乳化剂，涡旋混合1min，形成均匀乳液，然后静置5min，加入浓盐酸1.5ml，3000rpm离心时间5min，进行相分离，取10μl上层萃取相进行高效液相色谱分析，代入回归方程计算，双酚a35.5μg/l。

通过以上实施例，以及图1、表1和表2可以看出，本发明的测定方法具有高的检测灵敏度，方法已达到现有标准dbs13004-2015食品中11种双酚类物质的测定--高效液相色谱-串联质谱法检测灵敏度，而本发明方法的使用普及性及检测成本远低于目前常用的高效液相色谱-串联质谱法。本发明的方法具有宽的线性范围，低的检测限、好的回收率及重现性等优点。