同时检测M型磷脂酶A2受体和１型血小板反应蛋白7A域自身抗体免疫层析条及检测卡的制作方法

本发明涉及临床免疫学检测领域，具体涉及同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体免疫层析条及检测卡。

背景技术：

在我国成年人中肾脏病的患病率达到10.8％，每年有数百万人因肾脏病或引发心脑血管病死亡。其中膜性肾病(membranousnephropathy，mn)是导致成人肾病综合征的一个常见病因。目前膜性肾病诊断上主要依靠临床表现及肾穿刺，对病人来说是个痛苦、有风险、经济负担重的过程，因而很多患者选择了拒绝，错过了早期诊断和治疗的机会，延误了病情。如果能有其他医学手段，特别是血清学检查手段能对膜性肾病进行灵敏、准确地诊断和疗效评估，将是该疾病诊治的一个突破。膜性肾病是导致成人肾病综合征的常见病因，约30％～50％的患者将发展为终末期肾病。膜性肾病是一种自身免疫性疾病，其组织学特征表现为肾小球基底膜的增厚、igg的颗粒染色、补体系统组分的阳性呈现以及沿肾小球基底膜形成的免疫沉积复合物。膜性肾病可根据病因明确与否将其分为特发性膜性肾病(imn)和继发性膜性肾病(smn)。对于未检测到确切病因的膜性肾病，则被诊断为特发性或原发性膜性肾病。2009年，首次发现了存在于正常足细胞表面的膜性肾病的靶抗原：m型磷脂酶a2受体(pla2r)，在膜性肾病发病机制的研究中取得了突破性进展，70％的imn患者血清中有与pla2r特异性结合的抗体，但未在狼疮性膜性肾病或iga肾病患者的血清中发现，表明pla2r是imn的一个主要抗原。但还有10％以上的imn未检测到抗pla2r抗体，近期研究发现抗pla2r抗体阴性的imn患者血清中存在的针对1型血小板反应蛋白7a域(thsd7a)的自身抗体，并证实thsd7a是参与成人imn发病机制的第二个自身抗原。

免疫层析技术可以方便的进行自身抗体的检测，将此技术应用于膜性肾病的研究，可以通过血清学检测更准确地诊断特发性膜性肾病，患者容易接受，可以早期发现特发性膜性肾病，改变以往只有靠肾穿刺病理进行诊断的唯一方式，为膜性肾病的诊断和治疗提供一个非常便捷的新手段。非常有利于大规模的普查筛选及患者病程检测。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的是现有技术中的检测方法复杂的技术问题，提供一种操作简单、灵敏度高，可快速同时检测pla2r-igg和thsd7a-igg的胶体金免疫层析条及应用其的试剂卡。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体免疫层析条及检测卡，包括底板，以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、硝酸纤维素包被膜、抗体结合垫以及样品垫；其中，所述硝酸纤维素包被膜粘覆于所述底板的中间部位，且其上设置有相间隔的喷涂有pla2r和1型血小板反应蛋白7a域抗原的检测带和喷涂有羊抗兔lgg抗体的质控带，所述检测带靠近所述抗体结合垫，所述质控带靠近所述吸水纸；

作为优选的，所述抗体结合垫处喷涂有偶联了兔抗人igg的胶体金的聚酯膜；

作为优选的，所述吸水纸、所述硝酸纤维素包被膜、所述抗体结合垫以及所述样品垫之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠。

作为优选的，所述胶体金的粒径为1-150nm。

作为优选的，所述免疫层析条的宽度为0.3-2cm。

作为优选的，所述吸水纸、所述硝酸纤维素包被膜、所述抗体结合垫以及所述样品垫之间，依次与且仅与相邻部位部分重叠区域的重叠长度彼此独立的为1-5mm。

作为优选的，所述吸水纸与所述硝酸纤维素包被膜的所述部分重叠区域在所述硝酸纤维素包被膜的上侧。

作为优选的，所述底板是塑料底板。

本发明所述的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体免疫层析条及检测卡，包括所述的免疫层析条以及包覆所述免疫层析条的外壳；所述外壳进一步包括底座和卡盖，所述卡盖上设置有观察口和加样口，以露出免疫层析条的局部区域；所述加样口开口于所述样品垫上部，以露出部分或全部所述样品垫区域；所述观察口开口于所述包被膜上侧，以露出全部所述检测带和所述质控带。

作为优选的，所述底座为塑料底座。

作为优选的，所述卡盖为塑料卡盖。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

1、本发明所提供的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的胶体金免疫层析试剂条以胶体金为信号源，可实现快速、单人份检测，且灵敏度高、误差小，为临床使用提供了极大的便利。

2、本发明所提供的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的胶体金免疫层析试剂卡，体积小、便于携带，易于保存，有利于基层医院的应用与推广。

3、本发明所提供的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的胶体金免疫层析试剂卡，制备方法简单，可实现批量生产。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明所述同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的试剂卡的结构示意图；

图2是本发明所述同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体胶体金免疫层析条设置在底座上的主视图；

图3是本发明所述免疫层析条的侧视图。

图中附图标记表示为：1-底座、2-卡盖、3-免疫层析条、4-底板、5-样品垫、6-抗体结合垫、7-硝酸纤维素包被膜、8-吸水纸、9-pla2r抗体检测带、10-1型血小板反应蛋白7a域抗体检测带、11-质控带、12-加样口、13-观察口。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详述：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本发明公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。在附图中，为了清晰起见，会夸大层和区域的尺寸和相对尺寸。

下述实施例中，所述pla2r、thsd7a、兔抗人lgg、羊抗兔lgg抗体、磷酸缓冲溶液、牛血清白蛋白(bsa)、聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)、硼酸盐缓冲液、胶体金、蔗糖、聚酯膜、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、高强度吸水纸均为市售。

如图1-3所示，本发明提供同时检测pla2r-igg和thsd7a-igg的胶体金免疫层析条3，所述免疫层析条3包括底板4，以及沿所述免疫层析条3长度方向顺次粘覆于所述底板4上的吸水纸8、硝酸纤维素包被膜7、抗体结合垫6以及样品垫5；

本实施例中，所述硝酸纤维素包被膜7粘覆于所述底板4的中间部位，且其上设置有相间隔的检测带9、10和质控带11，所述检测带9在中间，检测带10靠近所述抗体结合垫6，所述质控带11靠近所述吸水纸8；

本实施例中，所述抗体结合垫6处喷涂有偶联了兔抗人igg的胶体金的聚酯膜；

本实施例中，所述吸水纸8、所述硝酸纤维素包被膜7、所述抗体结合垫6以及所述样品垫5之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠。

本实施例中，1)在包被膜的不同位置分别固定m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域和羊抗兔lgg抗体，形成检测带和质控带。

2)制备胶体金标记的兔抗人igg垫

3)底板上依次相互交错的黏贴上制备的样品垫，胶体金标记的兔抗人igg垫，包被膜和吸水纸，然后切割成宽度为0.5cm大小，装入塑料卡壳。

所述的包被膜的制备方法是：使用包被液(含有1-10％蔗糖的0.01-0.02mph7.2-7.6的磷酸盐缓冲液)，分别将m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域和羊抗兔lgg抗体稀释到1mg/ml-1.5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1ul/cm的量将三者以0.3cm-1.0cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干1-1.5h，加入干燥剂封存备用。

所述的胶体金标记的兔抗人igg的制备方法为：将胶体金和igg溶液分别以0.1mol/lk2co3调ph至9.0，电磁搅拌igg溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入5％胎牛血清(bsa)和1％聚乙二醇以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。超速离心法纯化胶体金标记的兔抗人igg。加入复溶液(含有0.05％-1％bsa，0.05％-0.1％tritonx-100,0.01m-0.05m的磷酸盐缓冲液)复溶至原体积，使用定量喷膜仪以3ul/cm-5ul/cm喷涂于聚酯膜上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。

使用时，在样品垫上加入样品液，在毛细作用下，样品液向吸水纸一段泳动，当待测标本中含有m型磷脂酶a2受体自身抗体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体时，自身抗体与胶体金上的兔抗人igg形成复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达包被m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域的检测线处，形成抗原-抗体-抗抗体夹心复合物，分别聚集在各自检测线。未结合的胶体金标记的兔抗人igg继续前行，到达质控线时，羊抗兔igg抗体与胶体金上的兔源性抗体结合，在质控线处出现胶体金的聚集。

本实施例还提供同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的检测卡，包括所述的免疫层析条3以及包覆所述免疫层析条3的外壳；所述外壳进一步包括底座1和卡盖2，所述卡盖2上设置有观察口13和加样口12，以露出免疫层析条3的局部区域；所述加样口12开口于所述样品垫5上部，以露出部分或全部所述样品垫5区域；所述观察口13开口于所述硝酸纤维素包被膜7上侧，以露出全部所述检测带9、10和所述质控带11。

本实施例中，所述样品垫5是玻璃纤维素膜。所述检测带9是涂布在所述硝酸纤维素上的pla2r抗原带，所述检测带10是涂布在所述硝酸纤维素上的thsd7a抗原带，质控带11是涂布在所述硝酸纤维素包被膜7上的羊抗兔lgg抗体带。

本实施例中，所述底板4是塑料底板。所述胶体金的粒径为1～150nm，本实施例优选50nm。所述胶体金是修饰有兔抗人igg抗体；所述吸水纸8优选高强度吸水纸；所述底座4是塑料底座，优选聚氯乙烯(pvc)板。

本发明所提供的同时检测m型磷脂酶a2受体和1型血小板反应蛋白7a域自身抗体的胶体金免疫层析试剂卡可实现快速、单人份检测，且灵敏度高，为临床使用提供了极大的便利；而且，体积小、便于携带，易于保存，有利于基层医院的应用与推广。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。