检测细胞的组合物及检测方法与流程

本发明涉及一种对样本中细胞进行定性和定量检测的方法，特别涉及一种利用金属颗粒具有的光特性，对样本中的细胞实施定性和定量检测的方法和组合物。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一类具有自我更新、多向分化潜能和低免疫原性的干细胞。相关研究表明，mscs可通过直接接触和旁分泌作用发挥免疫调节性能，从而抑制过度的免疫反应，维持局部微环境稳态，促进组织的修复，为炎症相关性疾病和自身免疫性疾病的治疗带来新的方向。而间充质干细胞的的灵敏检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。

金纳米颗粒因其独特的物理、化学性质以及极低的毒性在生命科学领域备受关注。1997年，mirkin等人初次报道了金纳米颗粒可由于彼此之间距离的差异而引起不同的颜色变化。近年来，基于金纳米颗粒聚集与否作为信号输出的相关裸眼比色检测展现了其便捷、快捷等优点。与此同时，国内外研究者通过将dna和纳米材料相结合，合成精确高效的纳米复合物，构建出多种新颖便捷的生物传感策略。常见的dna组装金纳米复合物往往是通过au-s键实现稳定结合，然而，由于灵敏度不足等原因，该方法在临床应用方面受到了限制。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种组合物，含有金属粒子，其在波长620nm下具有吸收峰的特性，用于对细胞实施定性检测。

本发明的另一个目的在于提供一种组合物，含有金属粒子，其在波长620nm下具有吸收峰的特性，且细胞浓度的对数值与620nm和520nm处的紫外吸收值之比(a620/a520)具有呈良好的线性关系，用于对细胞实施定量检测。

本发明的再一个目的在于提供一种检测细胞的方法，实现对样本中目标细胞的定性检测。

本发明的又一个目的在于提供一种检测细胞的方法，实现对样本中目标细胞的定量检测。

本领域技术人员可以理解，抗原和抗体系免疫学上对两种分子的表述，本发明中应理解为是一对能够互相特异性结合的分子，具有识别性。

本发明所称的抗原是类似于在肌体中引起特异性(免疫)应答的物质。抗原进入机体后，可刺激肌体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenicdeterminant)，亦称表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇。此外，通过基因工程或化学连接的方式对表位进行拼接所取得分子形式，也包含与本发明所称抗原的范围内。

本发明所称的抗体，应当理解为具有识别抗原并与抗原结合的分子，尤其是聚合物，常见的抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)。ig分五类，即igg、iga、igm、igd和ige。与免疫测定有关的ig主要为igg和igm。本发明中，抗体还包括具有识别抗原作用的分子，如：但不限于由ig衍生而来的抗体fab段、单链抗体、单域抗体和纳米抗体等也应属于此范畴。

本发明的目标细胞，系对样本中含有的拟检测的细胞总称，比如：体细胞、干细胞和癌细胞等。

一种组合物，包括：

多聚核苷酸，其5’端具有巯基；

金属银，其附着于多聚核苷酸，形成多聚核苷酸-ag纳米簇；

第一抗体，其与多聚核苷酸结合，用于与目标细胞结合，将多聚核苷酸-ag纳米簇固定于目标细胞上；

第二抗体，其偶联于磁性颗粒，用于与目标细胞结合；

金属金纳米颗粒；

寡聚核苷酸，其于溶液中时，附着于金属纳米颗粒表面。

本发明的组合物，还包括hno3，其作用于多聚核苷酸-ag纳米簇，溶出ag离子。

本发明的多聚核苷酸为单链dna，以此为模板形成多聚核苷酸-ag纳米簇，制备银纳米簇。

本发明的组合物，多聚核苷酸包括序列5′-tatataattcccacccac-3′。

本发明的组合物，寡聚核苷酸序列包括5′-cccccccccccc-3′，优先选择单链寡聚胞嘧啶。

本发明的组合物，所检测的目标细胞为间充质干细胞时，第一抗体为cd44抗体，第二抗体为cd90抗体。

本发明组合物用于对目标细胞进行定性检测，其检测方法如下：

将偶联第一抗体的多聚核苷酸-ag纳米簇加入含有目标细胞的待测样本，于37℃±0.5℃反应1～2小时，使得多聚核苷酸-ag纳米簇连接于目标细胞表面；

还加入偶联第二抗体的磁性颗粒，于25℃±0.5℃反应2～3小时，使得偶联第二抗体的磁性颗粒连接于目标细胞表面；

然后加入稀hno3(0.5～1m)以溶出银离子，于25℃±0.5℃反应2～3小时后，再加入金属金纳米颗粒与寡聚核苷酸混匀后，于波长400nm～800nm的可见-紫外光谱下检测，并在620nm处显示吸收峰，实现目标细胞进行定性检测。

本发明组合物用于对目标细胞进行定量检测，其检测方法如下：

将偶联第一抗体的多聚核苷酸-ag纳米簇加入含有目标细胞的待测样本，于37℃±0.5℃反应1～2小时，使得多聚核苷酸-ag纳米簇连接于目标细胞表面；

还加入偶联第二抗体的磁性颗粒，于25℃±0.5℃反应2～3小时，使得偶联第二抗体的磁性颗粒连接于目标细胞表面；

然后加入稀hno3(0.5～1m)以溶出银离子，于25℃±0.5℃反应2～3小时后，再加入金属金纳米颗粒与寡聚核苷酸混匀后，于波长400nm～800nm的可见-紫外光谱下检测，采用在620nm和520nm处的紫外吸收值之比建立与目标细胞浓度的对应曲线，实现目标细胞进行定量检测。

当目标细胞为间充质干细胞时，细胞浓度的对数值与检测体系在620nm和520nm处的紫外吸收值之比(a620/a520)之间呈良好的线性关系。线性方程为a620/a520＝0.1347+0.118lgcmsc(个细胞/ml)，r²＝0.993，检测限为2个细胞/ml。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的检测组合物，采用单链的多聚核苷酸和单链的寡聚核苷酸相组合，利用不同金属的光电特性，建立光谱吸收峰与目标细胞之间的关联性，实现对样本中目标细胞进行定性和定量检测。

本发明的检测组合物，可以根据检测的需要选择抗原-抗体对，通过选取具有特征性的抗原-抗体对，该组合物可以应用于不同靶标的分析检测，因而具有良好的普适性。

基于本发明的组合物，构建单链dna功能化金纳米颗粒的间充质干细胞的比色检测方法具有很好的灵敏性和特异性，实验操作方便，可以普遍应用于临床诊断和药物研发等领域。

附图说明

图1为本发明组合物用于检测细胞的原理示意图；

图2为裸金胶(a)，有待测细胞(b)或无待测细胞(c)的检测体系所对应的紫外-可见吸收光谱的曲线图；

图3为检测不同浓度间充质干细胞(从下至上分别为0个细胞/ml、10²个细胞/ml、10³个细胞/ml、10⁴个细胞/ml、5×10⁴个细胞/ml和10⁵个细胞/ml)时得到的紫外-可见吸收光谱和颜色图片；

图4为最终检测体系中金纳米颗粒在620nm处和520nm处紫外吸收值之比(a620/a520)与间充质干细胞浓度间的关系图，以及间充质干细胞浓度在0个细胞/ml～10⁵个细胞/ml范围内时a620/a520值与间充质干细胞浓度之间的线性关系图；

图5为检测各种对照细胞时得到的最终检测体系的a620/a520比值图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例一：间充质干细胞比色体系的构建，具体步骤如下：

以如下s1为模板合成银纳米簇，取3～5μl、100～150μms1与100～150μl、100～150μm的agno3混合，4℃反应20～30min；加入3～5μl、1～2mm的nabh4，剧烈震荡1～2min后，4℃反应2～3h；使用30k离心柱14,000r/min、10～15min过滤离心多聚核苷酸-ag纳米簇(dna-agncs)，收集上清备用。取5～8μl、10～15μm的4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(smcc)与3～5μl浓度1.3～2μm的cd44抗体混合，25℃反应2～3h活化抗体氨基。将活化后的抗体加入至上述上清液中，25℃反应2～3h，以得到交联成功的dna-抗体复合物。

接着，加入待测细胞溶液与交联后的抗体37℃孵育1～2小时，使银纳米簇于细胞表面上。取250～300μl浓度0.2～0.4mm的n羟基琥珀酰亚胺(nhs)与250～300μl浓度0.5～1mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与50～100μl浓度为10～20mg/ml羧基化的磁珠混合，25℃反应2～3h，以此达到活化磁珠。之后，加入3～5μl浓度为1.5～3μm的cd90抗体于上述溶液，于25℃反应2～3h，得到偶联cd90的磁珠。

取50～100μl偶联后的磁珠加入至连接了银纳米簇的细胞中，25℃反应2～3h，通过cd90的抗原-抗体反应捕获细胞。磁吸捕获细胞完毕的磁珠，使用超纯水清洗三遍。加入100～150μl浓度为0.5～1m的hno3溶解银纳米簇，25℃反应2～3h；加入200～300μl浓度为2～3nm的金属经纳米颗粒(aunps)与3～5μl浓度为100～200μm的s2混匀。加入5～10μl浓度为1～2mnacl溶液后，使用紫外-可见分光光度计记录其紫外图谱。

相关寡核苷酸dna链序列如下：

s1：5′-sh-c6-t(20)-atataattcccacccac-3′。

s2：5′-cccccccccccc-3′。

检测结果如图2所示。与裸金胶的曲线a相比，当未加入待测细胞时，体系中因缺少银离子而无法导致金纳米颗粒的聚集，仅因为体系中的背景干扰使得520nm处的紫外吸收峰略有下降(曲线b)。加入待测细胞后，由于细胞表面连接的银粒子被稀硝酸置换出来，并与aunps表面吸附的s2结合，引起了金纳米颗粒的聚集，因此在620nm处出现明显的吸收峰(曲线c)。以上结果表明利用单链dna功能化的金纳米颗粒聚集体系，可以实现对目标细胞的紫外表征。

实施例2间充质干细胞的定量检测

按实例1中的方法，在体系中中分别加入100μl含有不同浓度的间充质干细胞(0个细胞/ml、10²个细胞/ml、10³个细胞/ml、10⁴个细胞/ml、5×10⁴个细胞/ml、10⁵个细胞/ml)溶液进行紫外检测。图3显示了不同浓度的间充质干细胞对应的紫外-可见吸收光谱图以及金纳米颗粒随间充质干细胞浓度改变对应的颜色图片。图4显示了检测体系中金纳米颗粒在620nm和520nm处的紫外吸收值之比(a620/a520)随间充质干细胞浓度改变的情况。随着间充质干细胞浓度的提高，最终检测体系中金纳米颗粒520nm的峰值逐渐降低，620nm处的峰值逐渐上升，这说明随着细胞浓度的增加，越来越多的银离子被置换出来与金纳米颗粒表面的s2结合，促使金纳米颗粒聚集。同时，图4的插入图显示，该方法对间充质干细胞检测的线性范围为10²～10⁵个细胞/ml。在该范围内，细胞浓度的对数值与检测体系在620nm和520nm处的紫外吸收值之比(a620/a520)之间呈良好的线性关系。线性方程为a620/a520＝0.1347+0.118lgcmsc(即对间充质干细胞的浓度取对数)(个细胞/ml)，r²＝0.993，检测限为2个细胞/ml。

实施例3特异性研究

用cd44低表达的细胞(hepg2和l02)作为对照，按照上述方法，分别对浓度为10⁵个细胞/ml的细胞进行紫外-可见吸收光检测。从图中可以看出，在无细胞存在的空白对照组，最终反应体系的a620/a520值较弱；当检测cd44高表达的间充质干细胞时，反应体系所得到的a620/a520值有明显的提升，而对于cd44低表达的非特异性细胞，最终反应体系的a620/a520值与在空白对照中得到的结果基本相同。以上结果有效的证明，本实施例构建的基于单链dna功能化金纳米颗粒的间充质干细胞比色检测方法具有特异性。

由此，选择各种细胞表面的特异性抗原，本实施例的方案还能应用到其它细胞的检测中。

序列表

<110>章毅

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120>检测细胞的组合物及检测方法

<141>2019-02-19

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