一种利用银纳米球棒组装SERS基底检测大脑组织中多种氨基酸的方法与流程

本发明涉及氨基酸检测方法，具体涉及一种利用银纳米球棒组装sers基底检测大脑组织中多种氨基酸的方法。

背景技术：

人类的大脑一直是科学家们不懈研究的一个重要领域。英国一项新研究显示，人脑中一种名为“突触后致密体”的神经组织含有1000多种蛋白质，该组织病变会导致痴呆等130多种神经系统疾病，这项成果将有助于更有针对性地治疗相关疾病。英国桑格研究所等机构的研究人员12月19日在英国《自然—神经科学》(natureneuroscience)杂志上报告了这项成果。他们分析了接受大脑手术的一些病人的脑神经组织，在其“突触后致密体”组织中找到了1461种蛋白质。研究者指出，“突触后致密体”组织是大脑神经系统的一种关键组织，它位于连接不同神经细胞的突触上，如果出现病变，会导致早老性痴呆症、帕金森综合征、癫痫、儿童自闭症和学习功能障碍等130多种神经系统疾病。研究人员认为，在获取“突触后致密体”的蛋白质清单后，研究相关疾病时就可以按图索骥，直接检查有“嫌疑”的蛋白质，加快研究进程。

蛋白质是一种复杂的有机化合物。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合连成肽链。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类，数目，排列顺序和肽链空间结构的不同，所以说蛋白质的检测也就是氨基酸的检测。广州纤维产品检测研究院谢剑飞等人使用氨基酸自动分析仪测定含蛋白质组分的化学纤维中的氨基酸含量；安徽农业大学学报中报道了使用液相色谱-串联质谱直接测定茶叶中多种游离氨基酸的方法；中医药大学的唐晓雷等人用柱前衍生-hplc的方法测定了不同等级的梅花鹿鹿茸饮片中氨基酸的含量。但是这些方法都有一些限制，包括昂贵的设备和耗时的分析过程。表面增强拉曼光谱(sers)由于其高灵敏度检测，弱水背景和简单分析过程而受到广泛关注。到目前为止，已有许多sers应用被报道用于生物分析检测，药物输送，食品安全和环境科学。sers的高灵敏度依赖于贵金属结构附近的电磁场的巨大电磁增强。因此，sers活性底物在检测灵敏度中起重要作用。目前，大多数的sers基底通过复杂的物理或化学方法制备而成，没有通过已知的sers增强机制设计。因此存在许多不可预知的sers行为，影响了表面增强拉曼光谱技术在环境监测、生化检测和医药制备等领域的发展。

三维(3d)sers活性基底可以提供更大的金属纳米结构表面积，这可以产生更高密度的“热点”并捕获更多分子。因此，3d有序复合纳米结构的制造一直是基于sers的分析中的最新话题。例如，制备了具有丰富固有热点的多孔ag-ag合银纳米颗粒，其增强因子为～10⁷，并且在许多基于sers的应用中表现出高适用性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用银纳米球棒组装sers基底检测大脑组织中多种氨基酸的方法，通过有效发挥银纳米颗粒和银纳米棒的特性，使“热点”之间的相互藕合能力增强，以大幅增强sers效应，提高sers检测的灵敏度。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种利用银纳米球棒组装sers基底检测大脑组织中多种氨基酸的方法，包括以下步骤：

s1：利用柠檬酸钠还原硝酸银的方法制备银纳米颗粒；

s2：使用倾斜角沉积的方法制备银纳米棒阵列；

s3：将银纳米颗粒和银纳米棒阵列组装成由多个棒状结构单元构成的sers基底，棒状结构单元以银纳米棒为载体，银纳米颗粒分散在银纳米棒周围，两相邻银纳米棒间隔为105±10nm；

s4：利用sers基底对大脑组织中的多种氨基酸进行检测。

进一步的，所述步骤s1具体包括：称取0.018g硝酸银溶于100mll纯水中，加热至微沸。称取0.02g柠檬酸钠溶于2ml水中，将该溶液逐滴加入微沸的硝酸银溶液中，继续保持微沸腾约20min，放至室温冷却12h后得银纳米颗粒。

进一步的，所述步骤s2具体包括：将玻璃片切割成0.8cm×0.8cm，加入乙醇在超声波清洗机中清洗5min，重复三次，然后氮气吹干，固定在沉积室中；在压力小于5×10^-7torr真空沉积室中，通过电子束蒸发，在清洗干净的玻璃片上先后以0.2nm/s和0.3nm/s的速度先后沉积一层钛薄膜和银薄膜，然后旋转样品台使得基底法线与沉积方向夹角为86°，通过电子束蒸发，以0.3nm/s的速度生长银纳米棒阵列。

进一步的，所述步骤s3中具体包括：取5ml银胶溶液于离心管中，5000rpm转速下离心5min，用滴管移去上清液，得到浓缩后的银胶溶液；再将浓缩后的银胶溶液配比成原来的10倍，将步骤s1制备的银纳米颗粒与检测样品混合，然后转移到银纳米棒阵列表面，使银纳米颗粒与银纳米棒充分结合形成动态sers以进行定量检测。

进一步的，所述步骤s4具体包括：用干净的镊子取一小块组织，将其放入干净的离心管中，加入50μl浓缩银胶溶液，用细针反复戳捣、挤压银胶溶液中的组织，将此混合物超声混合15min，设置激光波长、功率、积分时间，对基底上被测物进行扫描，得到的表面增强拉曼光谱中，不同的特征峰标定不同种类的氨基酸，此特征峰的峰值的波数即可作为标定氨基酸的参考峰。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明制备过程简单、灵敏度高、增强效果显著、可修饰性及可重复性强、可大规模生产；能够有效发挥银纳米颗粒和银纳米棒的特性，而且能够使“热点”之间的相互藕合能力增强，从而大幅增强sers效应，提高sers检测的灵敏度。

附图说明

图1是本发明实施例中银银纳米球棒组装sers基底的制备和检测示意图；

图2是本发明实施例中银银纳米球棒组装sers基底检测不同大脑组织样品的光谱图；

图3是本发明实施例中银纳米球棒组装sers基底检测不同大脑组织样品的归一化光谱图。

具体实施方式：

实施例

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，一种利用银纳米球棒组装sers基底检测大脑组织中多种氨基酸的方法，具体包括以下步骤：

步骤一，准备银纳米颗粒，利用柠檬酸钠还原硝酸银的方法制备银纳米颗粒。称取0.018g硝酸银溶于100ml纯水中，加热至微沸。称取0.02g柠檬酸钠溶于2ml水中，将该溶液逐滴加入微沸的硝酸银溶液中，继续保持微沸约20min，放至室温冷却12h后得可使用的直径为85nm的银纳米颗粒。

步骤二，使用电子束蒸发沉积系统在干净的玻璃片上制备银纳米棒阵列。先后沉积一层钛薄膜和银薄膜，第三层银纳米棒长度为990nm，直径为100nm，两相邻银纳米棒间隔为105nm。

步骤三，取5ml银胶溶液于离心管中，5000rpm转速下离心5min，用滴管移去上清液，得到浓缩后的银胶溶液。再将浓缩后的银溶胶溶液配比成原来的10倍，将银纳米颗粒与检测样品混合(银胶浓缩液&0.9％生理盐水，v:v＝1:1)得到待测液，然后转移到银纳米棒阵列表面，等到表面快干，银纳米颗粒与银纳米棒充分结合形成动态sers“热点”时进行检测。

步骤四，用干净的镊子取一小块组织，将其放入干净的离心管中，加入浓缩银胶溶液，用细针反复戳捣、挤压银胶溶液中的组织，将此混合物超声混合15min。(目的是为了让组织中的液体进入银胶并与其充分接触)

步骤五，定量检测，激光波长为785nm、功率100mw、积分时间30s，对大脑组织不同样品进行检测，得到组织表面增强拉曼光谱图，并分析。

图2为银纳米球棒组装sers基底检测不同大脑组织样品的光谱图，图3为图2光谱图归一化处理后的表面增强拉曼光谱图，由图2和图3发现，这四种不同样品的sers特征峰峰位置大体一致，在477cm^-1，653cm^-1，724cm^-1，801cm^-1，906cm^-1，1048cm^-1，1094cm^-1，1125cm^-1，1218cm^-1，1332cm^-1，1446cm^-1，1585cm^-1处都有明显的特征峰，样品1号和2号在1289cm^-1处有特征峰，

表1大脑组织在sers基底上的增强信号峰位的归属与文献对比

从图2、3和表1中可以看出，利用银纳米球棒组装sers基底可以检测大脑组织中存在色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸，表明可以利用sers技术实现大脑组织中多种氨基酸的检测。