一种胶体金重悬液、胶体金试剂、胶体金试剂的制备方法与应用与流程

本发明涉及免疫学技术领域，更具体地说，特别涉及一种胶体金重悬液、胶体金试剂、胶体金试剂的制备方法与应用。

背景技术：

胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶。胶体金抗体标记溶液是指用蛋白质(抗原、抗体或spa、spg)标记胶体金后得到的溶液。由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。

在胶体金抗体标记溶液的制作过程中，需要对胶体金抗体标记初液即标记了抗体的胶体金溶液进行离心，去除上清液，得到胶体金抗体标记沉淀物，再使用胶体金重悬液对胶体金抗体标记沉淀物重悬，即让胶体金抗体标记沉淀物重新悬浮，以得到比较均匀的胶体金抗体标记溶液，制成胶体金试剂，胶体金试剂可以用于制作胶体金试纸。胶体金试剂和胶体金试纸用于抗原或抗体物质的检测。现有技术中，存在胶体金颗粒释放不单一、不稳定的问题，从而影响胶体金试剂或胶体金试纸检测抗体或抗原的测试结果的精确度。

技术实现要素：

本发明提供一种胶体金重悬液，能使重悬后的胶体金颗粒分布均匀、稳定性高。本发明还提供一种胶体金试剂的制备方法，制备出的胶体金试剂具有均一、稳定、不易老化、灵敏度高的特点。本发明还提供一种胶体金试剂和应用胶体金试剂制作的胶体金试纸，具有稳定性高、测试灵敏的特点。

一种胶体金重悬液，包括如下质量分数的各组分：

0.5％～1.2％的tris、0.1％～0.5％的柠檬酸三钠、0.01％～1％的brij、0.05％～3％的酪蛋白、0.1％～0.5％的吐温和1％～3％的蔗糖。

上述的一种胶体金试剂的制备方法，优选的，包括如下步骤：将胶体金抗体标记沉淀物采用权利要求1所述的胶体金重悬液复溶后得到所述胶体金试剂。

上述的一种胶体金试剂的制备方法，优选的，所述胶体金抗体标记沉淀物采用如下方法制备：

将抗体和牛血清蛋白加入胶体金溶液中，反应完成后得到胶体金抗体标记初液；

将所述胶体金抗体标记初液离心，弃上清液，得到所述胶体金抗体标记沉淀物。

上述的一种胶体金试剂的制备方法，优选的，将所述胶体金抗体标记初液离心的操作中，转速为7000～12000r/min，离心时间为8～30min。

上述的一种胶体金试剂的制备方法，优选的，所述抗体为人血白蛋白单克隆抗体。

一种胶体金试剂，使用如上所述的胶体金试剂制备方法制备而成。

上述的一种胶体金试剂的应用，使用如上所述的胶体金试剂制备胶体金试纸。

有益效果：本发明提供的胶体金重悬液能使重悬后的胶体金颗粒分布均匀、稳定性高。

本发明提供的胶体金试剂的制备方法，使用了本发明提供的胶体金重悬液，制备出的胶体金试剂具有均一、稳定、不易老化、灵敏度高的特点。

本发明提供的胶体金试剂和应用胶体金试剂制作的胶体金试纸，使用了本发明提供的胶体金重悬液，具有稳定性高、测试灵敏的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为检测一中实施例一的试纸的测试结果；

图2为检测一中对比例2-1的试纸的测试结果；

图3为检测一中对比例2-2的试纸的测试结果；

图4为检测二中的r1试纸的检测结果；

图5为检测二中的r2试纸的测试结果；

图6为检测二中的r3试纸的测试结果；

图7为本发明提供的胶体金色卡。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本发明提供一种胶体金重悬液，包括如下质量分数的各组分：0.5％～1.2％的tris、0.1％～0.5％的柠檬酸三钠、0.01％～1％的brij、0.05％～3％的酪蛋白、0.1％～0.5％的吐温和1％～3％的蔗糖。本发明提供的胶体金重悬液能使重悬后的胶体金颗粒分布均匀、稳定性高。

本发明还提供一种胶体金试剂的制备方法，包括步骤：将胶体金抗体标记沉淀物采用本发明提供的胶体金重悬液复溶后得到所述胶体金试剂。

其中，胶体金抗体标记沉淀物的制备包括以下步骤：

(1)将抗体和牛血清蛋白加入胶体金溶液中，反应完成后得到胶体金抗体标记初液；

(2)将所述胶体金抗体标记初液离心，弃上清液，得到所述胶体金抗体标记沉淀物。

本步骤用于去除胶体金抗体标记初液中未结合的抗体，以纯化胶体金抗体标记物。其中，将所述胶体金抗体标记初液离心的操作中，7000～12000r/min，离心时间为8～30min，以获得最佳的纯化效果。

其中，所述抗体为人血白蛋白单克隆抗体。在此处，抗体还可以替换成其他种类的抗体，以获得与抗体相应的抗原胶体金试剂，能获取与本发明的胶体金试剂相同的效果，即具有灵敏度高、稳定性高的特点。

本发明所提供的胶体金试剂的制备方法，由于使用了本发明提供的胶体金重悬液，能使得胶体金试剂中的胶体金颗粒分布均匀、稳定性好，从而使得制备出的胶体金试剂具有稳定性好、灵敏度高的特点。

本发明还提供一种胶体金试剂，用本发明所提供的胶体金试剂制备方法制备而成。

胶体金试剂由于使用了本发明提供的胶体金重悬液，能使得胶体金试剂中的胶体金颗粒分布均匀、稳定性好，从而使得制备出的胶体金试剂具有稳定性好、灵敏度高的特点。

本发明还提供一种胶体金试剂的应用，将本发明提供的胶体金试剂用于制备胶体金试纸，与胶体金试剂的效果相同，具有稳定性好，灵敏度高的特点。

下面结合具体实施例来对本发明的效果进行说明。

(一)材料制备

(1)配置胶体金重悬液

配置100ml的胶体金重悬液，胶体金重悬液的ph值为7.0-9.0，优选为7.4。

(2)制备胶体金试剂

步骤a：制备胶体金溶液。精确量取1l纯水于圆底烧瓶中，放入适量防暴沸玻璃珠，加热至沸腾，加入15ml的1％的柠檬酸三钠溶液，煮沸1min后加入10ml的1％的氯金酸溶液，待颜色稳定后继续加热8分钟，冷却后加纯水补充至1l。

步骤b：制备胶体金抗体标记沉淀物。取步骤a所得的胶体金溶液1ml，加入k2co3溶液调节ph至7.4，再加入10微克人血白蛋白单克隆抗体，搅拌反应20分钟后加入10ul的bsa，搅拌至反应完全，得到胶体金抗体标记初液。将胶体金抗体标记初液离心，离心转速为10000转/分钟，时间为10分钟，去除未结合的抗体，得到胶体金抗体标记沉淀物。

步骤c：重悬胶体金抗体标记沉淀物。加入0.5ml胶体金重悬液至胶体金抗体标记沉淀物中，搅拌至胶体金抗体标记沉淀物完全溶解，得到胶体金试剂。将该胶体金试剂称为r1试剂。

(3)制备胶体金试纸

步骤a：把步骤(2)所得的胶体金试剂涂布在面积为15平方厘米的玻璃纤维结合垫上，37℃抽风烘干，时间为24h，得到喷金后的玻璃纤维结合垫；

步骤b：再在硝酸纤维素膜上包被c线和t线，其中c线包被羊抗鼠igg，t线包被人血白蛋白抗原，45℃抽风烘干，时间为2h，得到包被后的硝酸纤维素膜；

步骤c：将步骤b包被好的硝酸纤维素膜进行组装并切割成条，得到胶体金试纸。

实施例1至3、对比例1-1、对比例1-2提供几种根据上述步骤制作的胶体金试纸，制作中其各自使用到的胶体金重悬液的各组分和质量分数如下：

表一实施例1-3、对比例1-1、1-2胶体金重悬液配方

对比例2-1、对比例2-2的胶体金重悬液的配置如下：

对比例2-1

对比例2-1的胶体金重悬液包括：1％的pvp40、1％的bsa、0.3％吐温20、5％的蔗糖以及10mmol/l的硼酸盐缓冲液，ph为7.4。将该配置的胶体金重悬液称为r2重悬液，所获取的胶体金试剂称为r2试剂，所获取的胶体金试纸称为r2试纸。

对比例2-2

对比例2-2的胶体金重悬液包括：0.05％的肌酸、1％的酪蛋白、0.3％吐温20、3％的蔗糖以及10mmol/l的磷酸盐缓冲液，ph为7.4。将该配置的胶体金重悬液称为r3重悬液，所获取的胶体金试剂称为r3试剂，所获取的胶体金试纸称为r3试纸。

(二)性能检测试验

检测一

取10张实施例一所得的r1试纸，分别滴加0mg/l，10mg/l，20mg/l，30mg/l，50mg/l五种浓度的人血白蛋白抗原溶液，每种浓度的人血白蛋白抗原溶液滴两张胶体金试纸，待所有胶体金试纸显色稳定后，比照胶体金色卡读取读数。

将实施例2、实施例3、对比例1-1，对比例1-2，对比例2-1，对比例2-2所得的试纸做相同的检测。

检测二

将实施例1所得的胶体金试纸命名为r1试纸，对比例2-1所得的胶体金试纸命名为r2试纸，对比例2-2所得的胶体金试纸命名为r3试纸，将r1试纸、r2试纸以及r3试纸分别放置0天、37摄氏度下3天、5天、7天，4摄氏度下7天后恢复至室温后测试，再加入浓度为0mg/l，10mg/，20mg/l，30mg/l，50mg/l的人血白蛋白抗原溶液进行测试。

(三)性能检测结果

检测一和检测二测试结果判断方法说明：胶体金试纸与不同浓度的抗原溶液结合后会有不同的显色，质控线c线显示为红色线条，当t线颜色越深，说明检测到的抗原浓度越低，当t线颜色越浅，说明检测到的抗原浓度越高。

本发明实施例提供一张胶体金色卡(如图7所示)，该胶体金色卡的读数有c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、b一共10个梯度，且这10个梯度从左至右对应的t线颜色依次变浅，c1表示t线颜色为最深，b表示t线颜色为最浅，几乎已不显色。

本发明提供的实施例通过将显色稳定后的胶体金试纸与图7所示的胶体金色卡进行比对来读数，图1-图6提供了实验中显色稳定后的胶体金试纸，比对胶体金色卡进行读数，读数结果如表二、表三所示。

其中，图4中有5组胶体金试纸，每组5张，从左至右的每组分别为r1试纸放置0天、37摄氏度下放置3天、37摄氏度下放置5天、37摄氏度下放置7天以及4摄氏度下放置7天的测试结果，每一组的5个读数分别为加入浓度0mg/l，10mg/，20mg/l，30mg/l，50mg/l人血白蛋白抗原溶液后的测试结果。

其中，图5中有5组胶体金试纸，每组5张，从左至右的每组分别为r2试纸的0天对照、37摄氏度下放置3天、37摄氏度下放置5天、37摄氏度下放置7天以及4摄氏度下放置7天的测试结果，每一组的5个读数分别为加入浓度0mg/l，10mg/，20mg/l，30mg/l，50mg/l人血白蛋白抗原溶液后的测试结果。

其中，图6中有5组胶体金试纸，每组5张，从左至右的每组分别为r3试纸的0天对照、37摄氏度下放置3天、37摄氏度下放置5天、37摄氏度下放置7天以及4摄氏度下放置7天的测试结果，每一组的5个读数分别为加入浓度0mg/l，10mg/，20mg/l，30mg/l，50mg/l人血白蛋白抗原溶液后的测试结果。

表二：检测一结果

表三：检测二结果

从表二的测验结果可知，实施例1-3的胶体金试纸相对于对比例的胶体金试纸的测试结果来说准确度和灵敏度更高，同时也说明实施例1-3的胶体金重悬液能使胶体金颗粒分布更均匀、更稳定。

表三的测验结果可知，r1试纸较r2试纸和r3试纸来说，r1试纸在37摄氏度环境下放置3天、5天或7天，在4度环境下放置7天后均仍能更为准确地测试出抗原溶液的浓度范围，可见r1试纸比r2试纸和r3试纸的测试更准确、更灵敏，同时也说明r1试纸使用的胶体金重悬液能使胶体金颗粒分布更均匀、更稳定。

以上对本发明所提供的一种胶体金重悬液、胶体金试剂、胶体金试剂的制备方法与应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。