头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定方法与流程

本发明涉及药物分析领域，特别是涉及一种头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定方法。

背景技术：

头孢类抗生素凭借抗菌谱广、抗菌活性强及副作用较小等优势，已成为临床应用最为广泛的抗菌药物之一。其临床应用最常见的不良反应为过敏反应。2016年国家药品不良反应监测年度报告指出，全年度药品不良反应事件报告涉及的怀疑药中，抗感染药占化学药品总例次数的43.9％。抗生素致敏原并非药物本身，而是其降解形成的高分子聚合物，与体内大分子载体发生不可逆结合，引起抗原-抗体反应，从而出现一系列过敏反应症状。高分子聚合物来源一般分为外源性(来源于发酵工艺的蛋白、多肽等结合物)及内源性(药物本身的聚合，及药物降解杂质间的聚合)。药品中高分子聚合物的含量直接影响过敏反应的发生率，所以要严格控制头孢类抗生素药物中的高分子聚合物的含量。

《中国药典》2015年版收载了10余种头孢类抗生素药物原料及其制剂的高分子聚合物检测方法，基本采用传统的分子排阻色谱法，但分子排阻色谱法对头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定不准确。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种含量测定较为准确的头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定方法。

一种头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定方法，包括如下步骤：

根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到所述供试品溶液的色谱图和所述对照溶液的色谱图，其中，所述供试品溶液为含有头孢类抗生素药物的溶液，所述对照溶液为所述供试品溶液的稀释液，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a包括水，所述流动相b包括甲醇，洗脱梯度为：0min-20min：33％～43％的所述流动相b；20min-35min：33％～43％的所述流动相b递增至48％～55％的所述流动相b；35min-36min：48％～55％的所述流动相b递减至33％～43％的所述流动相b；36min-45min：33％～43％的所述流动相b；

根据所述供试品溶液的色谱图和所述对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算所述头孢类抗生素药物中的所述聚合物的含量。

经实验证实，采用分子排阻法测定头孢类抗生物药物中的聚合物存在分离度较差和柱效较低的问题，而使测定的结果不准确。而上述头孢类抗生素药物中的聚合物的含量测定方法具有分离度较好、柱效高的优点，能够使头孢类药物中聚合物的含量测定的准确性更高，并用于头孢类抗生素药物的质量控制。

在其中一个实施例中，所述流动相a还包括ph调节剂，所述ph调节剂选自磷酸二氢铵及甲酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述ph调节剂为磷酸二氢铵，所述ph调节剂的摩尔浓度为0.2mol/l以下。

在其中一个实施例中，所述ph调节剂为甲酸，所述ph调节剂的体积百分浓度为0.2％以下。

在其中一个实施例中，所述根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。

在其中一个实施例中，所述根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，检测波长为278nm。

在其中一个实施例中，所述根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，柱温为30℃～40℃。

在其中一个实施例中，所述根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，进样量为10μl～20μl。

在其中一个实施例中，所述头孢类抗生素药物选自头孢呋辛酯原料及头孢呋辛酯制剂中的一种。

在其中一个实施例中，所述头孢呋辛酯制剂选自头孢呋辛酯片、头孢呋辛酯胶囊及头孢呋辛酯颗粒中的一种。

附图说明

图1为实施例1中的供试品溶液的高效液相色谱图；

图2为实施例2中的供试品溶液的高效液相色谱图；

图3为实施例3中的供试品溶液的高效液相色谱图；

图4为实施例4中的供试品溶液的高效液相色谱图；

图5为实施例5中的供试品溶液的高效液相色谱图；

图6为对比例1中的供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的头孢类抗生素药物中聚合物的含量测定方法，包括如下步骤：

步骤s110：根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图。

其中，供试品溶液为含有头孢类抗生素药物的溶液。进一步地，头孢类抗生素药物选自头孢呋辛酯原料及头孢呋辛酯制剂中的一种。更进一步地，头孢呋辛酯制剂选自头孢呋辛酯片、头孢呋辛酯胶囊及头孢呋辛酯颗粒中的一种。

头孢呋辛酯为二代头孢类抗生素，是头孢呋辛的前体药物，口服后迅速被胃肠道黏膜细胞中的非特异性酯酶水解，释放出头孢呋辛而发挥药效，适用于多种敏感细菌造成的感染，已成为世界畅销的抗感染药物。头孢呋辛酯的结构如下图：

头孢呋辛酯由glaxosmithkline(葛兰素史克公司)研制开发，头孢呋辛酯片于1987年9月3日在英国首次上市，随后在全球许多国家地区销售。1987年12月28日通过美国fda审批，1988年在美国上市，同年在日本上市，2000年在中国首次进口上市。头孢呋辛酯及其相关制剂收载于《中国药典》2015年版二部，但未收载头孢呋辛酯及其制剂的聚合物控制方法，药典现有有关物质检测方法也无法检出聚合物。

具体地，供试品溶液的配置方法为：取头孢类抗生素药物溶于甲醇，得到供试品溶液。更具体地，供试品溶液的配置方法为：精密称取头孢类抗生素药物适量，置于量瓶中，加10％体积的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，配制成每ml含头孢类抗生素药物0.5mg的溶液，滤过，作为供试品溶液。

其中，对照溶液为供试品溶液的稀释液。进一步地，对照溶液的配置方法为：将供试品溶液用水稀释50倍～1000倍，得到对照溶液。具体地，将供试品溶液用水稀释100倍，得到对照溶液。

其中，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以使头孢类抗生素药物的分离柱效更高。具体地，色谱柱的长度为150mm，色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱的填料的粒径为5μm。更具体地，色谱柱为watersx-bridgec18。

其中，流动相包括流动相a和流动相b。具体地，流动相a包括水，流动相b包括甲醇。

进一步地，流动相a还包括ph调节剂。更进一步地，ph调节剂选自磷酸二氢铵及甲酸中的至少一种。

在一实施例中，ph调节剂为磷酸二氢铵，ph调节剂的摩尔浓度为0.2mol/l以下。

在另一实施例中，ph调节剂为甲酸，ph调节剂的体积百分浓度为0.2％以下。

其中，洗脱梯度为：

0min-20min：33％～43％的流动相b；

20min-35min：33％～43％的流动相b递增至48％～55％的流动相b；

35min-36min：48％～55％的流动相b递减至33％～43％的流动相b；

36min-45min：33％～43％的流动相b。

进一步地，洗脱梯度为：

0min-20min：38％的流动相b；

20min-35min：38％的流动相b递增至50％的流动相b；

35min-36min：50％的流动相b递减至38％的流动相b；

36min-45min：38％的流动相b。

其中，根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，流速为0.8ml/min～1.2ml/min。进一步地，流速为1.0ml/min。

其中，根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，检测波长为278nm。

其中，根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，柱温为30℃～40℃。进一步地，柱温为35℃。

其中，根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测的步骤中，进样量为10μl～20μl。进一步地，进样量为20μl。

步骤s120：根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量。

具体地，采用公式c％＝ru/rs×100/n，计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量，其中，c％为头孢类抗生素中聚合物质量百分含量，ru为供试品溶液色谱图中聚合物峰峰面积值，rs为对照溶液色谱图中头孢类抗生素药物主峰峰面积值，n为对照溶液的稀释倍数。

主成分自身对照法具有无需对照品、成本低廉及操作简单等优势。

其中，头孢类抗生素药物中的聚合物一般为高分子聚合物。

上述头孢类抗生素药物中的聚合物的含量测定方法至少具有以下优点：

1)经实验证实，采用分子排阻法测定头孢类抗生物药物中的聚合物存在分离度较差和柱效较低的问题，而使测定的结果不准确。而上述头孢类抗生素药物中的聚合物的含量测定方法具有分离度较好、柱效高的优点，能够使头孢类药物中聚合物的含量测定的准确性更高，并用于头孢类抗生素药物的质量控制。

2)与传统的分子排阻色谱法相比，上述头孢类抗生素药物中的聚合物的含量测定方法具有简单快速、耐用性好及重现性好等优点。

3)上述头孢类抗生素药物中的聚合物的含量测定方法实现了采用rp-hplc法测定头孢呋辛酯及其制剂中头孢呋辛酯聚合物的含量，同时可控制其他杂质含量，比如，头孢呋辛、△³-异构体、e-异构体等，适用于头孢呋辛酯及其制剂的质量控制。而传统的分子排阻色谱柱仅能对聚合物进行测定，无法测定样品中的已知杂质和未知杂质的含量。

以下为具体实施例部分：

仪器与试药

仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪；梅特勒me204万分之一电子天平；梅特勒xp6百万分之一电子天平；

试药：头孢呋辛酯、头孢呋辛酯颗粒、头孢呋辛酯胶囊、头孢呋辛酯片；磷酸二氢铵(国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(j.t.baker)。

实施例1

本实施例的头孢呋辛酯原料中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)精密称取头孢呋辛酯原料适量(约相当于头孢呋辛50mg)，置于100ml量瓶中，加10ml的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液；

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(watersx-bridgec18，150×4.6mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为0.1mol/l磷酸二氢铵的水溶液，流动相b为甲醇；检测波长为278nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；柱温为35℃。洗脱梯度为：0min-20min：38％甲醇；20min-35min：38％甲醇递增至50％甲醇；35min-36min：50％甲醇递减至38％甲醇；36min-45min：38％甲醇；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量、头孢呋辛的含量、△³-异构体的含量、e-异构体的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图1所示，峰1为头孢呋辛，峰2和峰3为均头孢呋辛酯峰，峰4为△³-异构体，峰5和峰6均为e-异构体峰，峰7、峰8和峰9均为聚合物峰。

实施例2

本实施例的头孢呋辛酯原料中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)精密称取头孢呋辛酯原料适量(约相当于头孢呋辛50mg)，置于100ml量瓶中，加10ml的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液；

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(watersx-bridgec18，150×4.6mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为0.1％的甲酸的水溶液，流动相b为甲醇；检测波长为278nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；柱温为35℃；洗脱梯度为：0min-20min：38％甲醇；20min-35min：38％甲醇递增至50％甲醇；35min-36min：50％甲醇递减至38％甲醇；36min-45min：38％甲醇；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量、头孢呋辛的含量、△³-异构体的含量、e-异构体的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图2所示，峰1为头孢呋辛，峰2和峰3为均头孢呋辛酯峰，峰4为△³-异构体，峰5和峰6均为e-异构体峰，峰7、峰8和峰9均为聚合物峰。

实施例3

本实施例的头孢呋辛酯颗粒中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)取头孢呋辛酯颗粒，研细，混合均匀，精密称取适量(约相当于头孢呋辛50mg)，置于100ml量瓶中，加10ml的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液。

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(watersx-bridgec18，150×4.6mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为0.2mol/l的磷酸二氢铵水溶液，流动相b为甲醇；检测波长为278nm；流速为1.2ml/min；进样量为10μl；柱温为40℃；洗脱梯度为：0min-20min：33％甲醇；20min-35min：33％甲醇递增至55％甲醇；35min-36min：55％甲醇递减至33％甲醇；36min-45min：33％甲醇；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量、头孢呋辛的含量、△³-异构体的含量、e-异构体的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图3所示，峰1为头孢呋辛，峰2和峰3为均头孢呋辛酯峰，峰4为△³-异构体，峰5和峰6均为e-异构体峰，峰7、峰8和峰9均为聚合物峰。

实施例4

本实施例的头孢呋辛酯胶囊中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)取头孢呋辛酯胶囊，研细，混合均匀，精密称取适量(约相当于头孢呋辛50mg)，置于100ml量瓶中，加10ml的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液；

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(watersx-bridgec18，150×4.6mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为水，流动相b为甲醇；检测波长为278nm；流速为0.8ml/min；进样量为20μl；柱温为30℃；洗脱梯度为：0min-20min：43％甲醇；20min-35min：43％甲醇递增至48％甲醇；35min-36min：48％甲醇递减至43％甲醇；36min-45min：43％甲醇；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量、头孢呋辛的含量、△³-异构体的含量、e-异构体的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图4所示，峰1为头孢呋辛，峰2和峰3为均头孢呋辛酯峰，峰4为△³-异构体，峰5和峰6均为e-异构体峰，峰7、峰8和峰9均为聚合物峰。

实施例5

本实施例的头孢呋辛酯片中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)取头孢呋辛酯片，研细，混合均匀，精密称取适量(约相当于头孢呋辛50mg)，置于100ml量瓶中，加10ml的甲醇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液；

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(watersx-bridgec18，150×4.6mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇；检测波长为278nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；柱温为35℃；洗脱梯度为：0min-20min：38％甲醇；20min-35min：38％甲醇递增至50％甲醇；35min-36min：50％甲醇递减至38％甲醇；36min-45min：38％甲醇；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量、头孢呋辛的含量、△³-异构体的含量、e-异构体的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图5所示，峰1为头孢呋辛，峰2和峰3为均头孢呋辛酯峰，峰4为△³-异构体，峰5和峰6均为e-异构体峰，峰7、峰8和峰9均为聚合物峰。

对比例1

本对比例的头孢呋辛酯中的聚合物的含量测定方法如下：

(1)精密称取头孢呋辛酯适量(约相当于头孢呋辛25mg)，置25ml量瓶中，加甲醇5ml使溶解，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得到供试品溶液；

(2)精密移取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，得到对照溶液；

(3)根据高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照溶液进行检测，以获得到供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，其中，色谱条件如下：

色谱柱为以聚苯乙烯共聚物为填充剂的色谱柱(300×7.8mm，7μm)；流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为甲醇，流动相b为水，流动相a与流动相b的体积比为95:5；流速为1.0ml/min，检测波长为278nm，柱温为35℃，进样量为10μl；

(4)根据供试品溶液的色谱图和对照溶液的色谱图，采用主成分自身对照法计算头孢类抗生素药物中的聚合物的含量，并计算聚合物峰与相邻峰的分离度和头孢呋辛酯峰的理论塔板数，结果如表1所示，其中，供试品溶液的色谱图如图6所示，峰1和峰2均为聚合物峰，峰3为头孢呋辛酯峰。

表1

从表1可以看出，与对比例1相比，实施例1～5的聚合物的测定方法的聚合物峰与相邻峰的分离度较高，头孢呋辛酯峰的理论塔板数较高，说明实施例1～5的聚合物的测定方法的分离度较好、柱效较高，以使聚合物的含量测定更加准确。

采用对比例1的分子排阻法仅能对聚合物进行测定，无法测定样品中的已知杂质和未知杂质的含量。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。