果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法与流程

本发明属于农产品残留物的定性定量检测领域，具体涉及一种同时检测果蔬中百菌清、三唑酮、腐霉利、苯醚甲环唑四种杀菌剂的检测方法。

背景技术：

对植物有害的真菌、病毒等病原微生物有8万种以上，全世界的农作物由于植物病害造成大量减产，据联合国粮农组织(fao)统计，每年农作物因病害损失达10％—15％。化学杀菌剂的使用是防治植物病害的一种经济有效的方法。近年来开发和使用的农用杀菌剂主要有三唑类、甲氧基丙烯酸酯类、氨基酸衍生物类、酰胺类及其他类杀菌剂。这些农用杀菌剂活性高、作用机理独特、对环境友好，被广泛用于粮食、果蔬、经济作物的灰霉病、霜霉病等病害的防治。然而，由于农药安全意识和知识的匮乏，超剂量和超范围使用及不按安全间隔期进行采收等问题，以及对环境土壤的保护和人们身体健康的重视，许多国家都制定了农产品/食品中的限量标准。近几年农产品农药残留检测结果显示百菌清等杀菌剂药物是检出率较高的农药之一，其残留问题日益受到人们的关注。开发高通量和现场实时的快速检测技术，对于保障农产品安全具有重要意义。

目前对于多组分农药残留的分析，主要采用气相色谱，液相色谱或其质谱联用技术进行分离检测。近年气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)得到了较大的推广，其灵敏度高、特异性强。样品的提取多采用振荡均质、超临界萃取、加速溶剂萃取等方法。样品的净化采用凝胶渗透色谱、固相萃取、quechers(参见公开号cn105203661a)等方法进行样品净化。

dpx枪头式分散固相微萃取柱是一种新型的固相萃取技术，通过枪头式装置、分散型树脂萃取技术大幅度地提高了固相萃取速度，同时有效减少了溶剂的用量。dpx枪头式分散固相微萃取柱内部装填分散的吸附树脂，在适当溶剂条件下，特异性吸附目的化合物，经洗净缓冲液洗涤可除去非特异吸附杂质，再用洗脱缓冲液洗脱可使目的样品从相应树脂上分离，完成目的样品的纯化与浓缩。与分散固相萃取法相比，净化效果好，杂质干扰少。dpx枪头式分散固相微萃取柱结合了固相萃取法和分散固相萃取法的优点，对样品中杂质的净化彻底。

检测多个样品时，采用现有分散固相未萃取柱的前处理方式，存在时间长、效率低的问题，多个样品无法同步处理，并且存在因处理操作无法完全一致导致误差的风险。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，针对多个样品，可同步操作多个样品的前处理，尤其是基于dpx枪头式分散固相微萃取柱净化步骤的同步样品处理，确保多个样品的前处理完全一致，提高处理效率和检测准确度。

本发明解决上述问题所采用的技术方案为：果蔬中四种杀菌剂的高通量检测方法，步骤包括

(1)试样制备

取果蔬样品的可食用部分切碎、捣碎，均质混匀，密封，作为试样，冰冻保存；

(2)提取

称取试样于离心管中，准确加入毒死蜱-d10内标溶液，加入乙腈，振荡提取，离心取上清液，加入饱和氯化钠溶液和去离子水，作为待净化液；

(3)多样品同步净化

按照步骤(1)和(2)制备若干样品的待净化液，采用多通道固相萃取装置对多个待净化液进行同步净化，净化步骤包括：

(3.1)平衡活化：准备与样品数量相等的dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱，从dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱底端吸取乙腈，然后全部排出，重复1次或多次；

(3.2)取样结合：若干萃取柱从底端吸入步骤(2)中的待净化的样品，继续吸气形成湍流，吸附结合后将液体全部排出；

(3.3)洗涤：若干dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱从底端吸入去离子水，然后将液体全部排出，重复1次或多次；

(3.4)洗脱：若干dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱从底端吸入乙酸乙酯-正己烷混合溶液，将液体全部导出至样品瓶中，静止片刻，让液体分层，另吸取上层液体至内插管中，准确加入环氧七氯内标溶液；

(4)调试或优化气相色谱质谱检测条件；

(5)采用气相色谱－串联质谱分析，使用多反应离子监测模式和内标法定量分析样品中的百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂的含量。

上述步骤(3)提到的多样品同步净化是指采用多通道固相萃取装置对多个样品进行萃取步骤的同步吸液或吸气或排气、排液的操作。

步骤(4)中质谱检测条件优化是通过对四种目标检测杀菌剂、毒死蜱-d10内标、环氧七氯内标进行全扫描，得到保留时间和母离子，再通过产物离子扫描，优化出子离子和碰撞能量。

步骤(5)定量分析采用标准曲线法，为了消除背景干扰，采用空白基质液配制标准曲线，以空白的样品净化液配制四个杀菌剂的标准溶液制作校正曲线，进行定量分析和计算。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)样品前处理，通过dpx枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置对多个样品作同步净化处理，确保净化处理操作的一致性，省时、省力、提高了前处理的操作效率。气相色谱-三重四级杆串联质谱同时测定果蔬中百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂的含量。

(2)采用空白基质液配制标准溶液，和多反应检测(mrm)模式，降低了基质效应，提高了分析的准确性和灵敏度，试验结果更加精确。

(3)水果和蔬菜样品的含水量较高，可达约75％，选择乙腈等低极性溶剂作为提取剂，既可提高提取剂的浸润作用，也能减少提取液中的含水量，有利于后续的净化。

(4)样品经过优化的提取条件提取后,选用dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱对目标物进行净化，dpx枪头式分散固相微萃取柱将松散的树脂填放在移液枪头内，通过枪头式装置、分散型树脂萃取技术大幅度地提高了固相萃取速度，同时有效减少了溶剂的用量。实验结果表明，经过净化之后，目标化合物得以保留，样品中的杂质得到了较好的去除。dpx枪头式分散固相微萃取柱最大的优点是步骤简单，有效减少了有机溶剂的使用量，枪头末端的筛板装置可以过滤掉颗粒物，从而省去了离心等去除颗粒物的操作。

(5)利用多通道半自动固相萃取装置，同时处理1—24个样品的时间为10—20分钟，高通量，净化效率高，各萃取柱对样品进行同步净化操作，最大程度地实现所有样品净化处理的一致性。

附图说明

图1为本发明实施例固相萃取装置的结构示意图，图中未画出接气管；

图2为本发明实施例试样机构的结构示意图；

图3为本发明实施例移液机构的结构示意图；

图4为本发明实施例移液机构的部分结构示意图；

图5为本发明实施例多孔托板的结构示意图；

图6为本发明实施例密封盖板的结构示意图；

图7为本发明实施例试液盒的结构示意图；

图8为本发明实施例中萃取柱的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

基于gc-ms/ms方法检测蔬菜、水果中百菌清、苯醚甲环唑、腐霉利、三唑酮4种杀菌剂含量的检测方法，步骤包括

一、样品前处理

(1.1)采样和试样制备

番茄、苹果、小青菜均采自当地超市、农贸市场。取可食用部分切碎，用高速组织捣碎机，均质混匀，密封，作为试样，备用，置于-20℃保存。

(1.2)提取

称取10g试样，精确到0.01g于50ml离心管中，准确加入40μl毒死蜱-d10内标溶液(同位素内标物)，加入10ml乙腈，置于振荡涡旋器振摇15min，在4000r/min离心10min。准确吸取2.5ml上清液于试管中，加入2.5ml饱和氯化钠溶液和6ml去离子水，作为待净化液。

(1.3)净化

样品的净化通过dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置吸取溶液或样品。具体步骤如下：

按照步骤(1.1)和(1.2)制备若干样品的待净化液，采用多通道固相萃取装置对多个待净化液进行同步净化，净化步骤包括：

(1)平衡活化：连接5mldpx-rp枪头式分散固相微萃取柱和多通道半自动固相萃取装置，多个萃取柱从萃取柱底端吸入1ml乙腈，反复吸打3次后，静置30秒，将液体全部排出；(2)取样结合：用dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱吸取步骤(1.2)中的待净化的样品(约12ml)，分4次吸取，每次吸取3ml左右的待净化液，抬离液面，使dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱在待净化液液面以上，然后继续吸气，在萃取柱内形成湍流，静置30秒，结合后将液体排出，然后重新吸液、吸气、静置、排液，重复此操作共4次；(3)洗涤：萃取柱从底端吸入1ml去离子水，反复吸打3次后，静置30秒，将液体全部排出；(4)洗脱：从萃取柱底端吸入700μl的乙酸乙酯-正己烷(1:1,v:v)混合溶液，反复吸打3次后，静置30秒，然后将液体全部排出至样品瓶中，静止片刻，让液体分层，吸取上层液体(有机相)300μl至内插管中，准确加入12μl环氧七氯内标溶液，用气相色谱－串联质谱(gc-ms/ms)分析。

利用多通道半自动固相萃取装置，可同时处理24个样品，所需时间为10—20分钟，高通量，净化效率更高，24个样品的吸液、吸气、排液操作完全同步通量。

二、气相色谱-串联质谱(gc-ms/ms)工作条件

(1)色谱条件

安捷伦hp-5msultrainert色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：60℃保持1min，以40℃/min升至170℃，再以10℃/min升至310℃保持3min；进样量：1μl；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速：1.0ml/min；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样。

(2)质谱条件

采用电子轰击离子源(ei)；电子能量：70ev；离子源温度：300℃；溶剂延迟时间：4.08min；扫描方式：多反应离子监测(mrm)模式。各组分的保留时间、离子碎片信息、碰撞能量参见发明内容的表1，其中“*”为定量。环氧七氯用于检测仪器分析时的误差，并依照条件建立多反应监测方法。

表格1杀菌剂的保留时间、离子碎片信息、碰撞能量

三、检测方法的线性范围、检出限及定量限

采用标准曲线法对各杀菌剂进行定量分析，采用空白基质液配制标准曲线，即以空白的净化液配制相应的标准溶液制作校正曲线，称取7份空白样品，按照步骤(1-3)进行前处理，分别配制质量浓度为10、20、50、100、250、500、800μg/l的空白基质匹配标准工作液进行测定，以各杀菌剂的定量离子峰面积与对应的内标毒死蜱-d10峰面积比值为纵坐标y，对质量浓度x，单位μg/l，做线性回归，得到各组分农药的线性方程和相关系数。

采用加标回收的方法，以信噪比为3(s/n＝3)确定检出限(lod)，以信噪比为10(s/n＝10)确定定量限(loq)，结果参见表2，由表可知，在10—800μg/l的浓度范围内，4种杀菌剂的线性相关系数均大于0.999，呈现出良好的线性关系，4种杀菌剂的检出限为0.3—2.3μg/kg，定量限为1.2—6.7μg/kg，显示出较高的灵敏度。

表格2杀菌剂线性参数、检出限和定量限

四、回收率及精密度讨论

在优化后的实验条件下，分别在番茄、苹果和小青菜空白样品中做加标回收试验，在其中添加相当于样品含50μg/kg，250μg/kg和500μg/kg低、中、高3个浓度水平的杀菌剂混标，每个加标水平分别进行6次平行分析，计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表3。在3个添加水平下，4种杀菌剂的平均回收率为87.05％—115.81％，相对标准偏差(rsd)为0.29％—8.78％，表明本申请的检测方法的准确度和精密度均能达到满意结果，检测结果具有高的可靠性。

表格3各杀菌剂加标回收率和标准偏差

实施例二

dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置(本文其他部分也成为多通道固相萃取柱)，由移液机构1和试样机构2组成，移液机构1的吸气筒102类似注射器的原理，多个吸气筒与试样机构的24根枪头式分散固相微萃取柱实现萃取柱一一对应，当多个吸气筒同步动作时，可实现24根萃取柱的通量吸液、吸气、排液、排气，确保萃取操作的一致性。

移液机构包括移液孔板101、24根规格一致的吸气筒102，任一吸气筒102包括外筒1021和活塞1022，活塞1022的抽拉端设置有推片1024，类似于注射器原理，活塞1022可移动地设置在外筒1021内，外筒1021前端设置有气嘴1023，在活塞沿外筒内壁外抽时气嘴吸气。

外筒1021固定设置在水平腾空设置在移液孔板101上，为了实现24根吸气筒102的同步性，24根吸气筒102分为两组，每一组的12根吸气筒102呈线性排列，两组吸气筒相互平行。同时，同步件103的具有“工”字型截面，因为具有两条形长槽，呈线性排列的12个推片1024对应卡在其中之一的条形长槽内，呈线性排列的另外12个推片1024卡在另一条形长槽内。

另外，便于对同步件103的推拉操作，进一步在移液机构中配置推拉结构，设置一立柱，立柱的顶部高于移液孔板102，在立柱顶端设置相互啮合的齿条104、齿轮轴105，齿轮轴105配套有旋转手柄106竖直设置的齿条104连接至下方的同步件103，齿轮轴105驱动齿条105升降以上拉或下推同步件103。

试样机构2包括试样支架201、多孔托板202、密封压板203，多孔托板202水平腾空设置在试样支架201上，24根枪头式分散固相微萃取柱3悬挂在多孔托板202上，且萃取柱分为平行的两排，一排12根。密封压板203上设置有24个接气孔2031，多孔托板202设置有两个定位柱2021，密封压板203上相对应地设置有两个定位孔2032，通过定位柱对定位孔对准穿孔使密封压板203与多孔托板202精确盖合，盖合后、接气孔2031与dpx枪头式分散固相微萃取柱3顶部的通气塞盖一一对应联通形成气路。为了提高密封性，在定位柱2021穿过定位孔2032，露出于定位孔2032的定位柱2021上通过设置锁套2022使多孔托板202和密封压板203紧密对合。

24根吸气筒的气嘴1023通过24根接气管(图中未画出，但是根据本文记载不难理解所述的接气管为中空的塑料管)与24个接气孔2031的另一端一一对应接通，在同步件103同时抽拉活塞1022时24根枪头式分散固相微萃取柱3同步吸气，且吸气量一致。

再来，试样机构2还包括一个槽形试液盒4，试液盒4置于枪头式分散固相微萃取柱3下方，用于承接单个或多个枪头式分散固相微萃取柱流出的试液。

为了匹配不同长度的枪头式分散固相微萃取柱，多空托板的支撑高度应当设置为可调节：多孔托板202两端设置有滑套2023，两个滑套2023穿在试样支架201左右两根立柱2011上，两所套能够沿着立柱2011上下滑动以调节多孔托板202的高度。

在本实施例中采用大容量的吸气筒，如20ml，可以在较长的时间内一直吸入气体，形成湍流的时间长，混匀更充分，萃取净化的效果更好。

本实施例的dpx-rp枪头式分散固相微萃取柱结合多通道半自动固相萃取装置可实现24通道的样品同步通量吸液、吸气、排液、排气的萃取柱操作，确保各样品处理的一致性，当然，根据实际需要，也可以将24通道设计为12通道或其他规格。

除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围之内。