一种离体微血管内皮屏障功能检测方法与设备与流程

本发明属于基础医学实验技术和实验设备领域。具体涉及一种用于检测实验动物或人体离体微血管内皮屏障功能的实验方法及设备。

背景技术：

近年来，循环学研究热点逐渐从心--大血管水平向微血管转移，其中，微血管内皮的屏障功能是一个重要的研究方向。

微血管内皮在正常情况下，在细胞间由紧密连接蛋白和粘附连接蛋白构成细胞间连接，使水、氧、二氧化碳和葡萄糖等小分子物质通过细胞膜自由扩散，而隔绝血浆和组织液中的蛋白等大分子物质。在炎症、缺血--再灌注等病理条件下，微血管内皮间紧密连接失效，血浆内的蛋白等物质透过内皮渗漏入组织中，即微血管内皮屏障功能障碍。

现阶段，微血管内皮功能障碍研究方式主要有整体动物水平和细胞水平两种水平的实验技术。

整体动物水平的实验主要通过向动物循环系统注射荧光标记蛋白或尹文氏蓝等大分子物质，通过检测显微镜下荧光强度、组织匀浆吸光度值或冰冻切片荧光等方式来检测血管是否发生了内皮屏障功能障碍。

整体动物实验虽然是微血管内皮屏障功能的最主要研究方法，但存在的较多的缺陷：由于在体内存在复杂的代谢过程，难以利用拮抗剂、激活剂及药物等对微血管内皮屏障功能的生理、病理机制进行深入探讨；由于动物间存在个体差异，整体动物法需要的较多例数的重复实验，增加了研究经费和劳动量；对于实时监测的实验，只能定性描述渗漏发生不能提供定量的渗漏程度指标，对于定量检测的组织匀浆法，由于只能检测终点情况，不能知道时间--作用关系。同时，最广泛使用的两种血管内标记物中，荧光标记的血浆蛋白价格昂贵，按体重的整体给药方式用量巨大，极大的提高了实验预算；而伊文氏蓝具有较强的毒性和较弱的荧光强度，在危害实验者健康的同时对实验结果也有不利影响。

另外在细胞水平，也通过各种原代血管内皮细胞或内皮细胞系（株）进行培养，在形成连续单层后，以跨细胞膜阻抗或细胞连接蛋白荧光染色法检查细胞间紧密连接情况，表征血管内皮屏障功能。

可是在培养传代过程中，细胞的分化特征逐渐退化，且生长环境由于缺少内皮下基质层诱导而缺乏细胞极性，导致培养的单层内皮细胞与血管内皮的生理特征具有较大差异。此指标只能侧面提示内皮屏障功能障碍的可能，证据效应较弱。

离体器官组织水平实验是机能学实验的重要组成部分，离体组织水平在排除了机体神经、体液因素和代谢环境干扰的同时，保持组织的特异性结构与部分功能，能够良好的解决上述整体和细胞水平研究方法的不足。但针对微血管内皮屏障功能，尚无离体组织水平检测技术。

技术实现要素：

本发明就是针对上述问题，提供一种不必须使用剧毒或荧光标记蛋白的离体微血管内皮屏障功能检测方法与设备。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明的离体微血管内皮屏障功能检测设备，包括恒温装置，其特征在于：恒温装置内为血管外环境室，血管外环境室内设置有半透膜室，半透膜室两端设置有与外界连通的血管灌流入管和血管灌流出管，血管外环境室上设置有外室灌流入管、外室灌流出管和供氧管。

作为本发明的一种优选方案，所述血管灌流入管通过调压缓冲泵与具有恒温装置的血管内灌流液罐相连；血管灌流出管通过调压缓冲泵与灌注液收集皿相连。

作为本发明的另一种优选方案，所述外室灌流入管和外室灌流出管均经过双通道蠕动泵，并分别与外室灌流液罐和外室液收集皿相连。

作为本发明的第三种优选方案，所述半透膜室上设置有与外界连接的小室液引出管和稳压管，稳压管与小室内压稳定器相连。

本发明的离体微血管内皮屏障功能检测方法，其特征在于：将动物或人体瘤旁组织微血管分离，将微血管两端分别与血管灌流入管和血管灌流出管相连，建立管内流路，微血管内灌流含可测量的高分子物质的生理灌流液；以含有半透膜壁的半透膜室封闭微血管段外空间，此半透膜室可允许离子、葡萄糖、水中溶氧和水分子等小分子物质自由通过，但隔绝高分子物质；在半透膜室外设开放的血管外环境室，血管外环境室中充满等渗、含葡萄糖的生理溶液，同时充氧，通过检测各时间点半透膜室中的高分子物质含量，以及透过微血管壁的高分子物质量表征血管内皮屏障功能。

作为一种优选方案，微血管内灌流使用血清或含有血清蛋白的血清代替溶液，半透膜室和血管外环境室使用不含蛋白的常用生理溶液，用蛋白定量法检测半屏蔽小室中的蛋白含量。

进一步的，所述不含蛋白的常用生理溶液为任氏液或人工脑脊液。

本发明的有益效果：1、本发明采用原位离体微血管段，可体现各器官原位微血管功能特异性。

2、灌流采用调压缓冲泵，在实验设计需要的情况下，可检测不同压力条件对血管内皮屏障功能的影响。

3、隔离的血管内流路和血管外池环境，允许体现不同生理病理调件下，器官原位环境与血管内环境的不同，具有良好的验证效果。

4、通过少量的拮抗剂对离体血管进行孵育，即可展开通路阻断式研究，为深入研究生理、病理机制提供条件，减少经费支出。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

附图中1为小室内压稳定器、2为小室液引出管、3为血管外环境室、4为半透膜室、5为恒温装置、6为血管内灌流液罐、7为调压缓冲泵、8为血管灌流入管、9为微血管、10为外室灌流入管、11为氧气瓶、12为供氧管、13为外室灌流液罐、14为双通道蠕动泵、15为外室液收集皿、16为外室灌流出管、17为稳压管、18为灌注液收集皿、19为血管灌流出管。

具体实施方式

本发明的离体微血管内皮屏障功能检测设备，包括恒温装置5，其特征在于：恒温装置5内为血管外环境室3，血管外环境室3内设置有半透膜室4，半透膜室4两端设置有与外界连通的血管灌流入管8和血管灌流出管19，血管外环境室3上设置有外室灌流入管10、外室灌流出管16和供氧管12。

作为本发明的一种优选方案，所述血管灌流入管8通过调压缓冲泵7与具有恒温装置5的血管内灌流液罐6相连；血管灌流出管19通过调压缓冲泵7与灌注液收集皿18相连。

作为本发明的另一种优选方案，所述外室灌流入管10和外室灌流出管16均经过双通道蠕动泵14，并分别与外室灌流液罐13和外室液收集皿15相连。

作为本发明的第三种优选方案，所述半透膜室4上设置有与外界连接的小室液引出管2和稳压管17，稳压管17与小室内压稳定器1相连。

本发明的离体微血管内皮屏障功能检测方法，其特征在于：将动物或人体瘤旁组织微血管9分离，将微血管9两端分别与血管灌流入管8和血管灌流出管19相连，建立管内流路，微血管9内灌流含可测量的高分子物质的生理灌流液；以含有半透膜壁的半透膜室4封闭微血管9段外空间，此半透膜室4可允许离子、葡萄糖、水中溶氧和水分子等小分子物质自由通过，但隔绝高分子物质；在半透膜室4外设开放的血管外环境室3，血管外环境室3中充满等渗、含葡萄糖的生理溶液，同时充氧，通过检测各时间点半透膜室4中的高分子物质含量，以及透过微血管9壁的高分子物质量表征血管内皮屏障功能。

作为一种优选方案，微血管9内灌流使用血清或含有血清蛋白的血清代替溶液，半透膜室4和血管外环境室3使用不含蛋白的常用生理溶液，用蛋白定量法检测半屏蔽小室中的蛋白含量。

进一步的，所述不含蛋白的常用生理溶液为任氏液或人工脑脊液。

供氧管12与氧气瓶11相连。

实施例：取动物组织，置于预氧饱和的生理溶液中，显微镜下分离约5毫米无分支且直径在100～400微米的微血管9，小心剥离周围结缔组织，离断血管，用显微手术线将血管一端结扎至已排气的血管灌流入管8上，小心地冲去血管内血液，将另一端结扎至血管灌流出管19上，定压灌注血管内灌流液。更新溶液后封闭半透膜室4，保持血管外环境室3的通氧和液体更新，运行梯度血管冲洗激活程序，结束后，更新半透膜室4溶液，给予相应刺激后，通过抽取和检测内室溶液中的物，计算微血管9内皮功能障碍的时间和渗漏速率。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。