一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法与流程

本发明属于水产品检测
技术领域：
，是一种用高效液相色谱-串联质谱法(lc/esi-ms/ms)测定水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法。
背景技术：
：呋喃苯烯酸钠属于人工合成的呋喃类抗菌药物，主要运用在动物和鱼类的细菌预防和治疗中。但是，世界卫生组织和联合国粮农组织联合报道硝基呋喃类药物具有潜在的致突变和致癌性。为了保护消费者的健康,世界各国政府纷纷禁止了硝基呋喃类药物在食品动物上所有目的的使用。我国在农业部235号公告中属于禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出。目前,关于呋喃苯烯酸钠检测方法的研究报道很少,仅见于饲料、猪肉、鸡肉、乳制品以及鱼血清等的检测，国内对于海产品中呋喃苯烯酸钠的检测标准很少且检出限很高，不能满足进出口贸易中各国对呋喃苯烯酸钠残留限量要求。技术实现要素：本发明提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，以解决水产品中呋喃苯烯酸钠残留量检出限高的问题。本发明提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，样品采用甲酸水分散，以叔丁基羟基茴香醚作为保护剂，用乙腈提取，经亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，正己烷和c18柱净化，碱性条件下减压浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行测定，对样品中呋喃苯烯酸钠残留量进行定性和定量分析。优选地，包括以下步骤：(1)以呋喃苯烯酸钠标准物质配制标准储备液，以50％甲醇水溶液将标准储备液稀释成不同浓度梯度的标准工作溶液。(2)在水产品样品中加入1％甲酸水分散混合，加入乙腈提取，以叔丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂进行保护，超声波萃取，得到样品提取物；在水产品样品中加入并加入不同浓度梯度的标准工作溶液后，再加入1％甲酸水分散混合，加入乙腈提取，以叔丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂进行保护，超声波萃取，得到加标提取物。(3)在样品提取物和加标提取物中均加入亚铁氰化钾和乙酸锌去除蛋白后，再加入氯化钠进行液液分配。取上层有机相并加入同等量的水，加入正己烷去除油脂后，取下层至固相萃取仪中，使用c18柱作为固相萃取柱，以50％乙腈水洗脱接收，洗脱液加入氯化钠液液分配，加入氨水后，减压浓缩，用50％甲醇水溶液定容，过0.22μmptfe微孔滤膜后，得到样品提取溶液和加标提取溶液。(4)将标准工作溶液进lc/esi-ms/ms中分析，绘制标准曲线。(5)将样品提取溶液和样品加标溶液进lc/esi-ms/ms中分析，进行定性和定量测定。优选地，色谱条件为：色谱柱：c18柱，50×2.1mm，1.8μm，或性能相当者。流速：0.4ml/min。柱温：35℃。进样量：3μl。梯度洗脱：流动相a为含5.0mmol/l醋酸铵的0.1％甲酸溶液，流动相b为乙腈。可选地，质谱条件为：离子化模式：电喷雾离子源esi，负离子模式。干燥器温度：300℃。干燥器流速：8l/min。鞘气温度：350℃。鞘气流速：11l/min。毛细管电压：2500v。雾化器：高纯氮，45psi。嘴电压：2000v。扫描模式：多反应选择监测mrm。可选地，洗脱程序为：0-2min：流动相a80％→50％，流动相b20％→50％；2.0-2.8min：流动相a50％，流动相b20％；2.8-3.2min：流动相a50％→10％，流动相b50％→90％；3.2-4.5min：流动相a10％→80％，流动相b90％→20％；4.5-5.5min：流动相a80％，流动相b20％。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，样品采用甲酸水分散，以叔丁基羟基茴香醚作为保护剂，用乙腈提取，经亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，正己烷和c18柱净化，碱性条件下减压浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行测定，对样品中呋喃苯烯酸钠残留量进行定性和定量分析。本发明先加入甲酸水，目的一、将样品有效的分散，有助于物质更好的提取，目的二、提高呋喃苯烯酸钠在乙腈中的溶解度。由于呋喃苯烯酸钠在光照下容易分解，加入叔丁基羟基茴香醚作为保护剂，可以有效的控制呋喃苯烯酸钠的分解现象，提高数据的可靠性。考虑到后续净化和简化流程等问题，选用乙腈作为提取溶剂。在c18柱净化方面，考虑到柱子的承载情况，净化前先加入亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白再加入正己烷去油，起到初步去杂的作用，使c18起到更好的净化效果。通过调整乙腈和水的比例，使目标物与杂质更好的在柱子上分离开。由于呋喃苯烯酸钠在碱性条件稳定，故在减压浓缩时加入一定量的氨水，确保其稳定。本发明提高了目前水产品中呋喃苯烯酸钠残留量检测方法的可靠性，对准确科学的评价水产品质量安全中具有重要意义。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。附图说明为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为标准工作溶液的色谱图(0.002μg/l)；图2为鳗鱼提取溶液的色谱图；图3为鳗鱼加标溶液的色谱图。具体实施方式本发明提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，以解决水产品中呋喃苯烯酸钠残留量检出限高的问题。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明的目的实验室在日常检测呋喃苯烯酸钠时得到可靠的检测结果，以保证所食用的水产品对人体无害。提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，样品采用甲酸水分散，以叔丁基羟基茴香醚作为保护剂，用乙腈提取，经亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，正己烷和c18柱净化，碱性条件下减压浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行测定，对样品中呋喃苯烯酸钠残留量进行定性和定量分析。对于检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法的具体实施方式可以参看以下实施例。实施例1本实施例1提供了一种检测水产品中呋喃苯烯酸钠残留量的方法，包括以下步骤：步骤s010，配制标准工作液。以呋喃苯烯酸钠标准物质配制标准储备液，以50％甲醇水溶液将标准储备液稀释成不同浓度梯度的标准工作溶液。标准工作溶液的浓度为1μg/l、2μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l。步骤s020，制备样品提取物和加标提取物。包括步骤s021和步骤s022，具体如下：步骤s021，制备将水产品组织匀浆，并避光的样品袋中保存，制成待测的水产品样品。在水产品样品中加入1％甲酸水分散混合，加入乙腈提取，以叔丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂进行保护，超声波萃取，得到样品提取物。步骤s022，在水产品样品中加入并加入不同浓度梯度的标准工作溶液后，再加入1％甲酸水分散混合，加入乙腈提取，以叔丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂进行保护，超声波萃取，得到加标提取物。步骤s030，制备样品提取溶液和加标提取溶液。在样品提取物和加标提取物中均加入亚铁氰化钾和乙酸锌去除蛋白后，再加入氯化钠进行液液分配。取上层有机相并加入同等量的水，加入正己烷去除油脂后，取下层至固相萃取仪中，使用c18柱作为固相萃取柱，以50％乙腈水洗脱接收，洗脱液加入氯化钠液液分配，加入氨水后，减压浓缩，用50％甲醇水溶液定容，过0.22μmptfe微孔滤膜后，得到样品提取溶液和加标提取溶液。步骤s040，将标准工作溶液进lc/esi-ms/ms中分析，绘制标准曲线。步骤s050，将样品提取溶液和样品加标溶液进lc/esi-ms/ms中分析，进行定性和定量测定。步骤s040和步骤s050中lc/esi-ms/ms的色谱条件如下：a)色谱柱：c18柱，50mm×2.1mm(i.d.)，1.8μm，或性能相当者。b)流速：0.4ml/min。c)柱温：35℃。d)进样量：3μl。e)流动相：a为0.1％甲酸溶液(含5.0mmol/l醋酸铵)，b为乙腈。表2液相色谱仪的洗脱程序时间(min)a(％)b(％)流速(ml/min)0.0080200.402.0050500.402.8050500.403.2010900.404.5080200.405.5080200.40步骤s040和步骤s050中lc/esi-ms/ms的质谱条件如下：a)离子化模式：电喷雾离子源(esi)，负离子模式；b)干燥器温度：300℃；c)干燥器流速：8l/min；d)鞘气温度：350℃；e)鞘气流速：11l/min；f)毛细管电压：2500v；g)雾化器：高纯氮，45psi；h)嘴电压：2000v；i)扫描模式：多反应选择监测(mrm)。表3mrm中母离子、子离子和碰撞能量表①定性测定在相同测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在±5以内，且检测到的定性离子的相对丰度，与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强碎片离子丰度比符合下列要求。按照上述方法，如图1、2和3所示，分别是标准工作溶液、鳗鱼提取溶液和鳗鱼加标溶液的色谱图。通过对比发现鳗鱼提取溶液的色谱图没有呋喃苯烯酸钠的响应，初步分析其不含呋喃苯烯酸钠。鳗鱼加标溶液中有明显的呋喃苯烯酸钠的响应。表4基峰与次强碎片离子丰度比要求次强碎片离子相对离子丰度％>50>20-50>10-20≤10允许相对偏差％±20±25±30±50②定量测定设定仪器条件，待仪器稳定后，将标准工作溶液、样品提取溶液和样品加标溶液等体积进样测定，外标法定量。标准工作溶液、样品提取溶液和样品加标溶液中的呋喃苯烯酸钠的响应值均在仪器检测的线性范围之内。按照上述方法，如图1、2和3所示，分别是标准工作溶液、鳗鱼提取溶液和鳗鱼加标溶液的色谱图。以标准工作溶液色谱图中定量离子对的标准色谱峰面积y为纵坐标，以标准工作溶液相应离子的浓度值(ng/ml)x为横坐标，作标准曲线，获得呋喃苯烯酸钠的线性回归方程。判断鳗鱼提取溶液和鳗鱼加标溶液中的呋喃苯烯酸钠响应值是否在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本
技术领域：
中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。当前第1页12