高通量筛选护肤品用活性组合物的方法与流程

本发明涉及筛选护肤品用活性组合物的方法，尤其涉及通过构建大容量的待筛选多肽文库来筛选护肤品用活性组合物的方法。

背景技术：

多肽是由氨基酸经肽键连接而成的一类化合物，其在连接方式上与蛋白质相同。通常将含有氨基酸数量少于100个的称为多肽，而氨基酸数量小于10个的称为寡肽。目前寡肽的来源一般有两种：化学合成或天然哺乳动物细胞分泌。对于化学合成，寡肽一般可以通过固相合成技术直接合成和进行基团修饰，能够有效得到高纯度的单一肽。对于天然多肽因子，其可以广泛来源于哺乳动物细胞的体外培养，通过调整培养条件和细胞种类，能够获得多种多样的天然多肽因子混合物。

现代科学技术的飞速发展和广泛应用给美容化妆品行业带来了全新的发展机遇，护肤品已经从化学美容、植物美容向生物美容和基因美容方向发展。具有显著美容功效的多肽(也称胜肽)逐步运用到了中高端功效型护肤品中。多肽的使用至今已有20多年，它们在国外已有广泛应用。多个国家的知名品牌推出了多肽类化妆品，例如，玉兰油，雅芳，雅诗兰黛，兰蔻，欧莱雅，香奈儿，迪奥，sk-ii等。

目前，护肤品多肽的使用主要是依赖每一种多肽的已知生物学功能。事实上，各类多肽(无论是合成型多肽还是天然细胞分泌的混合多肽)都可以有效激活人体皮肤细胞的复杂信号通路，从而获得多样化的效果。尤其是，同样的多肽在不同的浓度、不同的多肽组合、配比下都可以在多种皮肤生物学场景下发挥出异常多样的效果，而目前的生物学认知还无法理性地预测多种多肽组合使用的效果。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本文提供了一种高通量筛选护肤品用活性组合物的方法，包括:

(1)使用两种或两种以上的已知多肽构建多种多肽组合物，或者通过培养细胞获得多种细胞培养上清液；

(2)让所述多肽组合物或所述细胞培养上清液与护肤品用体外筛选模型细胞接触，并检测所述护肤品用体外筛选模型细胞的活性变化，

其中通过所述护肤品用体外筛选模型细胞的活性变化确定所述多肽组合物或所述细胞培养上清液是否能够用作护肤品用活性组合物。

在一些实施方案中，所述已知多肽为寡肽。

在一些实施方案中，所述已知多肽选自表1中所示寡肽的两种或两种以上。

在一些实施方案中，所述构建多种多肽组合物包括调整所述多肽组合物中含有的多肽种类和/或多肽的浓度和/或浓度比例。

在一些实施方案中，步骤(1)中所述多种细胞培养上清液通过改变细胞培养条件而获得。

在一些实施方案中，所述细胞培养条件包括细胞类型、细胞传代次数、培养基组成以及培养环境。

在一些实施方案中，步骤(1)中所用细胞为哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞为干细胞。

在一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述干细胞选自脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述护肤品用体外筛选模型细胞选自抗皱纹模型细胞、美白模型细胞和生发模型细胞。

在一些实施方案中，所述抗皱纹模型细胞为皮肤成纤维细胞，所述美白模型细胞为黑色素细胞，所述生发模型细胞为真皮乳头细胞。

在一些实施方案中，在所述护肤品用体外筛选模型细胞为皮肤成纤维细胞时，检测所述皮肤成纤维细胞在uva辐射处理后的存活率变化；在所述护肤品用体外筛选模型细胞为黑色素细胞时，检测所述黑色素细胞的酪氨酸酶活性变化；在所述护肤品用体外筛选模型细胞为真皮乳头细胞时，检测所述真皮乳头细胞的vegf表达水平变化。

本文提供的方法通过构建极其多样化的待筛选文库，能够针对不同的皮肤护理问题，按需筛选出最优的多肽因子组合，从而理性地应用于护肤品中。

附图说明

图1显示了本发明人工合成库和天然库的构建示意图。

图2显示了本发明筛选方法的操作流程示意图。

图3显示了实施例3中抗皱纹模型筛选结果。

图4显示了实施例4中美白模型筛选结果。

图5显示了实施例5中生发模型筛选结果。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

本文中使用的“多肽组合物”指包含两种或两种以上多肽的混合物。可以通过调整其中的具体多肽种类、多肽种类的数量、多肽的浓度、多肽之间的相对浓度比例、多肽修饰方式等获得多种多肽组合物，即多肽组合物文库。多肽组合物中包含的多肽通常为已知多肽，可以通过人工合成方式获得，因此这种多肽组合物文库也可称为人工合成库。

本文中使用的“细胞培养上清液”指细胞培养期间的细胞外溶液，其通常可以通过离心沉降去除细胞而获得。细胞培养上清液中一般含有培养基成分和细胞向外分泌的细胞因子和其它分子(核酸、脂质等)。例如，已知细胞会通过旁分泌效应(paracrineaction)(区别于内分泌长程效应)分泌某些细胞因子对邻近靶细胞(可以是同种细胞也可以是异种细胞)产生生物学作用，这是细胞发挥其生理功能的最主要途径之一。可以通过调整细胞类型和细胞来源、控制培养环境(温度、湿度、co2浓度等)、调整培养基成分等方式让细胞向外分泌不同成分，从而形成多种多样的细胞培养上清液，构成细胞培养上清液文库。相对于上文的人工合成库，该细胞培养上清液文库可以称为天然库。

图1显示了人工合成库和天然库的构建示意图，其中人工合成库以寡肽为例。显然，本文中使用的多肽组合物或细胞培养上清液在数量上和复杂度上明显高于目前本领域已知的护肤品用活性化合物，它们构成了本文提供的高通量筛选方法的筛选对象。

利用本文提供的方法，可针对不同的皮肤问题，采用适合的细胞筛选模型并结合相应的检测指标，对这些人工合成库和天然库进行体外高通量筛选，能够快速获得效果最佳的活性组合物，无论其来自人工合成库还是来自天然库(图2)。

以下通过具体实施例进一步阐述本发明。

实施例

实施例1.天然库的构建

本实施例使用间充质干细胞(包括但不限于骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞等)，通过不同培养条件以及所培养的间充质干细胞来源的改变，形成各种不同的细胞培养上清液。

该培养条件包括以下所有可选条件的组合：

干细胞基础培养基(例如，stempro^tmmscsfmxenofree，thermofisher)

细胞源：脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞

代数选择：p3、p6、p9

co2浓度：2％、5％、8％

维生素c浓度(μg/ml)：20、35、50

胰岛素浓度(μg/ml)：2、4、8

运铁蛋白浓度(μg/ml)：2、4、6

亚硒酸钠(ng/ml)：2、4、8

可选条件共计：3⁷＝2187种，即通过2187种不同的培养条件，获得2187种不同组成配比的混合多肽因子成分，可用于下游基于不同场景问题的多肽因子组合的筛选。本研究对细胞分泌物进行了初步鉴定，它们主要由50个氨基酸以下的多肽组成，另外包含约15％的大型蛋白质(大于100个氨基酸)、核酸以及脂质成分。不排除多肽以外的成分也可能是功效成分。

实施例2.人工合成库的构建

合成如下表1中所示的寡肽，通过它们彼此组合，包括种类选择、浓度选择、修饰方式选择、相比比例选择等方式，构成灵活多样的多肽组合物文库。

表1用于构成人工库的寡肽

实施例3.通过皮肤问题导向的体外细胞模型筛选活性化合物

3.1抗皱纹细胞筛选模型

将人皮肤成纤维细胞(hsf)以1×10⁴个/孔接种于384孔板，加入dmem培养液(含10％fbs)约35μl，待细胞贴壁后12小时，对孔板整体进行uv-a的紫外辐照10j/cm²，建立uva辐照光老化模型。进一步培养6小时，每孔加入3μl待筛选的多肽因子原液组合(来自实施例1的天然库或实施例2的人工合成库，300μg/ml)。dmem培养液(含10％fbs)继续培养48小时。弃去上清，用pbs漂洗两次；再向各孔加入100μl的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(mtt)溶液，继续培养4小时后，小心吸弃上清，每孔加入150μldmso，振摇15分钟，使沉淀充分溶解，利用酶标仪(spectramaxplus384microplatereader(moleculardevicescat.#plus384))测定570nm波长处的吸光度。将绝对吸光度高的多肽成分组合(与细胞存活率高对应)作为期望的活性组合物。

图3显示了以实施例1的天然库为筛选对象的检测结果，提示本方法可以筛选获得具有较佳抗皱纹效果的活性组合物。对应所筛选出的最佳活性化合物的细胞培养条件组合为：脐带间充质干细胞，p6，5％co2浓度，20μg/ml维生素c浓度，4μg/ml胰岛素浓度，4μg/ml运铁蛋白浓度，以及2ng/ml亚硒酸钠浓度。

3.2美白细胞筛选模型

将小鼠b16黑色素细胞以1×10⁴个/孔接种于384孔板，加入dmem培养液(含10％fbs)约35μl，待细胞贴壁后12小时，每孔加入3μl待筛选的多肽因子原液组合(来自实施例1的天然库或实施例2的人工合成库，300μg/ml)。继续培养48小时，弃去上清，用pbs漂洗两次。每孔加入25μl含1％tritonx-100的pbs，震荡仪震荡90秒，重复一次。每孔加入2.5μl的10mm左旋多巴(l-dopa)，37℃孵育60分钟后，在酶标仪(spectramaxplus384microplatereader(moleculardevicescat.#plus384))中490nm处测量各孔的吸光度值。利用如下公式进行酪氨酸酶活性抑制率的折算：抑制率＝(1-待测孔吸光度值/空白无处理孔对照吸光度值)×100％，将抑制率高的多肽成分组合作为期望的活性组合物。

图4显示了以实施例1的天然库为筛选对象的检测结果(纵坐标为抑制率)，提示本方法可以筛选获得具有较佳美白效果的活性组合物。对应所筛选出的最佳活性化合物的细胞培养条件组合为：脂肪间充质干细胞，p9，5％co2浓度，35μg/ml维生素c浓度，8μg/ml胰岛素浓度，4μg/ml运铁蛋白浓度，以及4ng/ml亚硒酸钠浓度。

3.3生发细胞筛选模型

将真皮乳头细胞以1×10⁴个/孔接种于384孔板，使用dmem培养液(含10％fbs)25μl培养12小时后，每孔加入3μl待筛选的多肽因子原液组合(来自实施例1的天然库或实施例2的人工合成库，300μg/ml)。继续培养48小时后小心吸弃培养液，pbs漂洗两次，立即加入25μl生物素标记的血管内皮生长因子(vegf)抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，于37℃温育1小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒；甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。每孔加入20μl链霉亲和素-hrp，轻轻振荡混匀，于37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒；甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。每孔加入hrp底物a、b各15μl，轻轻振荡混匀，于37℃温育10分钟，并避免光照。取出酶标板，迅速加入15μl终止液。加入终止液后应立即测定结果。利用酶标仪，测定450nm波长处各孔的od值。将绝对吸光度高的多肽成分组合作为期望的活性组合物。

图5显示了以实施例1的天然库为筛选对象的检测结果，提示本方法可以筛选获得具有较佳生发效果的活性组合物。对应所筛选出的最佳活性化合物的细胞培养条件组合为：脐带间充质干细胞，p3，5％co2浓度，50μg/ml维生素c浓度，4μg/ml胰岛素浓度，2μg/ml运铁蛋白浓度，以及2ng/ml亚硒酸钠浓度。

本发明所属领域技术员应理解，以上描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。