聚乙二醇用于动物组织切片油脂染色的应用的制作方法

本发明属于病理组织切片制作技术领域，具体涉及聚乙二醇用于动物组织切片油脂染色的应用。

背景技术：

脂质是中性脂肪、类脂及其衍生物的总称，主要是指中性脂肪。正常情况下，除脂肪细胞外，其他细胞内一般不见或仅有少量脂滴。当发生病变时，细胞中会出现脂滴或脂滴明显增多，特别是心、肝、肾等实质器官发生脂肪变性时，胞浆内会出现大小不一的空泡，需用脂肪染色鉴别空泡是属于脂肪变性还是水样变性或糖原贮留。另外，动脉粥样硬化时，内皮细胞下的脂质沉积，可用脂肪染色显示脂质。

脂类易溶于有机溶剂，不能用石蜡切片进行诊断检测。因为石蜡切片在制片、染色过程中需经过酒精、二甲苯等有机溶剂进行脱蜡处理，会将脂类等清除。因此石蜡切片不可用于脂类的病理检测。

在日常病理检测及科研中，脂肪染色常采用冰冻切片制片，油红o染色。冰冻切片制备是将组织经oct包埋剂包埋成形后，在-20℃环境下用冰冻切片机将组织块切成5～15μm的切片，然后进行油红o染色。染色过程中由于切片过厚，染色及附贴切片时容易产生折叠，影响切片质量。热胀冷缩现象会导致脂滴聚集在一起，使脂肪细胞呈“空泡状”，染色结果呈阴性改变，并且切片不能长久保存，需及时观察，存在一定的局限性。

碳蜡，又名聚乙二醇，是一种水溶性高分子化合物，有一系列从低到中等分子量的产品。碳蜡的物理形态可以从无色透明粘稠液(分子量200～700)到白色蜡质半固体(分子量1000～2000)直至坚硬的蜡状固体(分子量3000～20000)。碳蜡完全溶于水，并能和很多物质相溶，有很好的稳定性和表面活性，低毒且无刺激性。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种聚乙二醇用于动物组织切片油脂染色的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

聚乙二醇用于动物组织切片油脂染色的应用。

一种利用聚乙二醇进行动物组织切片油脂染色的方法，包括如下步骤：

(1)取动物组织样品，经固定液固定后，流水冲洗，吸水纸吸干水分；

(2)将动物组织样品置于碳蜡i中进行浸蜡处理；

(3)再将动物组织样品置于碳蜡ii中进行浸蜡处理；

(4)随后将动物肝脏组织样品放在组织包埋盒中，加入足量熔化的碳蜡ii，自然冷却，

待碳蜡凝固成形后，用石蜡切片机切片，切片后常温蒸馏水展片，烤片；

(5)切片无需脱蜡，用蒸馏水稍洗，直接入苏木素染色2min；稍微水洗，0.5％盐酸迅速分化，水洗后0.5％氨水返蓝；然后用70％乙醇轻轻洗切片数秒，油红o染色10min，70％乙醇迅速分化，空气中晾干，甘油明胶封片。

上述方案中，碳蜡i为分子量1000～2000的聚乙二醇。

上述方案中，碳蜡ii为分子量1500与分子量1000的聚乙二醇按3:1～1:3混合的聚乙二醇混合物。

上述方案中，步骤(2)和步骤(3)所述浸蜡处理的条件为：置于55～65℃温箱中处理1～3h。

上述方案中，步骤(3)所述浸蜡处理的次数为3～5次。

上述方案中，步骤(4)所述烤片的条件为：37～42℃温箱中烤片2～4h。

上述方案中，步骤(4)中所述动物组织包埋切片的厚度为3～5μm。

本发明中，碳蜡包埋具有冰冻切片和石蜡包埋的一些特点：

(1)可以从“水固定相”直接包埋切片，由于碳蜡在高温下是液体，室温下是固体，可按不同比例溶于水，可以直接浸入组织细胞内；

(2)组织固定后无需经酒精脱水、二甲苯脱蜡等步骤，可直接用梯度分子量的碳蜡脱水包埋，避免酒精、二甲苯等脂溶剂对脂质的破坏，最大程度保存脂质；

(3)由于减少了脱水、透明等程序，能尽量避免组织块收缩变形，保存组织细胞内酶的活性、抗原性，完全适用于酶组织化学和分子杂交等技术；

(4)可以用普通石蜡切片机切片。

本发明的有益效果：(1)利用聚乙二醇优秀的水溶性特点，采用聚乙二醇作为脱水剂，在脱水过程中同时包埋实现介质的渗透、包埋成形，形成的组织包埋块具有石蜡块的外形特点，同时组织包埋块经水洗即可去除包埋介质，无需使用有机溶剂处理，避免了有机溶剂处理导致脂类流失的问题。(2)本发明所述方法制备的组织切片厚度为3～5μm，避免了冰冻切片过厚导致组织叠片的问题。(3)本发明所述方法制备的组织切片经油红o染色后，因聚乙二醇脱水渗透，使大部分脂滴完好保存于细胞质中，避免了冰冻切片中脂滴发生移位的问题，也避免了冰冻切片中因低温产生冰晶导致组织结构不完整的问题。

附图说明

图1为正常小鼠肝脏碳蜡包埋切片油红o染色，200倍镜下照片。

图2为脂肪肝小鼠肝脏碳蜡包埋切片油红o染色，200倍镜下照片。

图3为脂肪肝小鼠肝脏冰冻切片油红o染色，200倍镜下照片。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一种利用聚乙二醇进行小鼠肝脏动物组织切片油脂染色的方法，包括如下步骤：

(1)取正常健康小鼠肝脏组织样品，大约0.5cm×0.5cm×0.5cm，经固定液固定后，流水冲洗，吸水纸吸干水分；

(2)将小鼠肝脏组织样品置于碳蜡i(分子量为1000的聚乙二醇)中，于60℃温箱中浸蜡处理60min；

(3)再将小鼠肝脏组织样品置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按1:2混合而成)中，于60℃温箱中浸蜡处理60min；

(4)再将小鼠肝脏组织样品置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按1:1混合而成)中，于60℃温箱中浸蜡处理60min；

(5)再将小鼠肝脏组织样品置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按2:1混合而成)中，于60℃温箱中浸蜡处理60min；

(6)随后将小鼠肝脏组织样品放在组织包埋盒中，加入足量熔化的碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按2:1混合而成)，自然冷却，待碳蜡凝固成形后，用石蜡切片机切片，切片的厚度为5μm，切片后常温蒸馏水展片，于37℃温箱中烤片2h；

(7)切片无需脱蜡，用蒸馏水稍洗，直接入苏木素染色2min；随后稍微水洗，0.5％盐酸迅速分化，水洗后0.5％氨水返蓝；70％乙醇轻轻洗切片数秒，饱和油红o染液染色10min；70％乙醇迅速分化，空气中晾干，甘油明胶封片。

将本实施例制备所得油脂染色后的动物组织切片置于显微镜下观察，结果如图1所示，正常小鼠肝脏中存在少量脂滴，脂滴呈圆形，位于细胞质中分布于核周，定位准确。

实施例2

一种利用聚乙二醇进行脂肪肝小鼠肝脏切片油脂染色的方法，包括如下步骤：

(1)脂肪肝模型小鼠经麻醉处死后，立即取肝脏组织样品，大约0.5cm×0.5cm×0.5cm，经固定液固定后，流水冲洗，吸水纸吸干水分；

(2)将小鼠脂肪肝置于碳蜡i(分子量为1000的聚乙二醇)中，于55℃温箱中浸蜡处理90min；

(3)再将小鼠脂肪肝置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按1:2混合而成)中，于55℃温箱中浸蜡处理120min；

(4)再将小鼠脂肪肝置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按2:1混合而成)中，于55℃温箱中浸蜡处理120min；

(5)再将小鼠脂肪肝置于碳蜡ii(分子量1500与分子量1000的碳蜡按2:1混合而成)中，于55℃温箱中浸蜡处理120min；

(6)随后将小鼠肝脏组织样品放在组织包埋盒中，加入足量熔化的碳蜡ii，自然冷却，待碳蜡凝固成形后，用石蜡切片机切片，切片的厚度为4μm，切片后常温蒸馏水展片，于40℃温箱中烤片2h；

(7)切片无需脱蜡，用蒸馏水稍洗，直接入苏木素染色2min；随后稍微水洗，0.5％盐酸迅速分化，水洗后0.5％氨水返蓝；70％乙醇轻轻洗切片数秒，饱和油红o染液染色10min；70％乙醇迅速分化，空气中晾干，甘油明胶封片。

将本实施例制备所得油脂染色后的动物组织切片置于显微镜下观察，结果如图2所示脂肪肝模型小鼠的肝脏发生脂肪病变，有大量被油红着色的脂滴，定位于胞浆内，脂滴未发生移位，细胞核显示清楚。

对比例

现有技术中采用冰冻切片油红o染色的方法包括如下步骤：

(1)脂肪肝模型小鼠经麻醉处死后，取肝脏立即取肝脏组织样品，大约0.5cm×0.5cm×0.5cm，经固定液固定后，流水冲洗，吸水纸吸干水分。

(2)将小鼠肝脏置于15～30％梯度蔗糖溶液中进行脱水24～36h，至组织沉入管底，代表脱水完成；

(3)脱水后的肝脏组织用oct包埋剂包埋，冰冻切片机切片，切片厚度8～10μm，切片直接贴附于防脱载玻片上，于-20℃保存；

(4)染色前，冰冻切片在室温复温10min，蒸馏水稍洗，直接入苏木素染色2min；随后稍微水洗，0.5％盐酸迅速分化，水洗后0.5％氨水返蓝；

(5)70％乙醇轻轻洗切片数秒，饱和油红o染液染色10min；70％乙醇迅速分化，空气中晾干，甘油明胶封片。

图3为脂肪病变小鼠肝脏冰冻切片油红o染色结果，图中可见小脂滴形状不典型，大的脂滴明显移位，定位不准确，脂滴连成大片并浮于组织上方，导致细胞核非常不明显。相比较对比例图3，采用本发明方法制备所得切片染色后(见图1和图2)，较小的脂滴呈典型的颗粒状，大的脂滴均位于细胞内细胞核周围，定位准确，细胞核未被脂滴遮盖，显示明确。综上，我们认为本发明阐述的碳蜡包埋切片制片方法对于组织中脂类物质的定位显示优于现有冰冻切片制片方法。