一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法与流程

本发明涉及一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法，属于腺嘌呤核苷三磷酸的检测技术领域。

背景技术：

腺嘌呤核苷三磷酸作为几乎所有生命形式的主要燃料分子，在生化反应调节中起着重要作用，如基因复制，细胞代谢，生物合成，药物传递，免疫和神经介导。已发现生物体中腺嘌呤核苷三磷酸的异常浓度和比例与许多疾病密切相关，包括缺氧，低血糖，缺血，帕金森病和一些恶性肿瘤。因此，在达到危及生命水平之前准确快速地检测腺嘌呤核苷三磷酸在生化研究和临床诊断中非常重要。

近年来，已经开发了很多方法来检测腺嘌呤核苷三磷酸，例如光电化学适体传感器，表面增强拉曼散射，光磁适体传感器，电化学发光，荧光光谱，和化学发光共振能量转移，这些方法对腺嘌呤核苷三磷酸检测显示出明显的优点，然而，通常涉及复杂的操作，灵敏度不足，昂贵的设备和大的背景干扰，这限制了它们的应用。

微流控纸芯片作为新型设备能够通过毛细作用实现无动力流体运输，网状分布的纤维能够储存试剂，高的表面积与体积比，并且具有制作过程简单、易携带、成本低、生物相容性和生物降解能力好等优点，在人类疾病诊断，食品安全检查和环境监测等领域有较好的应用。

技术实现要素：

针对目前存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种设计合理，成本低廉，操作简便，环境友好且灵敏度高的纸基双模式设备的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1.在计算机上利用adobeillustratorcs6软件设计一个十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的a4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水区域，样式如附图1所示，其中1为电极标签，2为检测区，3为中空区域，4为反应区，5为超级电容器标签。

2.采用丝网印刷的方法，将碳工作电极印刷到检测区，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到电极标签，碳电极印刷到反应区，碳线印刷到绿色区域作为工作电极和超级电容器的桥梁，将中空区域中疏水蜡包围的圆形亲水区域居中进行打孔；将红色区域的实线进行切割，虚线进行折叠，形成一个立体结构。

3.对检测区的圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长海胆状状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80ml二次水倒入三口烧瓶中加热至90℃，并加入800μl质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.8ml质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15min，自然冷却得到金种子溶液，取20μl得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，将100μl200mmol/l的抗坏血酸和100μl质量分数为1%的氯金酸溶液混合，取20μl混合溶液滴加到修饰有金种子的工作区域，静置30min，用二次水冲洗3次，其次，取10μl100mmol/ldna1滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，在4℃下孵育一夜，用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液多次冲洗掉未固定的dna1，继续滴加10μl40nmol/l的aptamer在环境温度37℃下孵育50min，用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液pbs缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干，继续滴加10μl的1%的牛血清白蛋白进行封闭，在室温下反应50min，取10μldna2/葡萄糖氧化酶复合物于工作区域，并于37℃环境反应2小时，将此工作区域用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液冲洗以减少非特异性吸附。

4.在反应区圆形亲水区域进行修饰，具体步骤为：20μl100mmol/l的铁氰化钾滴加到圆形亲水区域，自然晾干，重复三次，继续滴加20μl100mmol/l的葡萄糖溶液，静置晾干，重复三次。

5.在超级电容器标签预留空白区域制作超级电容器，具体步骤为：首先，在超级电容器标签预留空白区域用碳铅笔均匀的涂覆，形成导电电极，随后，通过将6g用乙醇醇化的聚乙烯醇粉末，6g磷酸和60ml二次水混合在一起并加热至85℃直至溶液变澄清来制备固态电解液，将石墨涂覆的纸浸入固态电解液中恒定一段时间并取出，重复2~3次，紧接着置于蒸发皿中并在烘箱中干燥，当电解质干燥时，用碳铅笔将石墨涂覆在电解质上以形成夹层结构。

6.在检测区圆形亲水工作区域滴加含有腺嘌呤核苷三磷酸的待测溶液，自然晾干，其次，通过折叠将检测区与反应区域的圆形亲水区重叠，工作电极和碳线接触，用夹子固定，样式如图，10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液滴加到检测区圆形亲水工作区，通过数字万用表检测电流并记录，清洗检测区的圆形亲水工作区域之后，使检测区和电极标签重叠，用夹子固定，样式如图，与电化学工作站连接，将40μl含有10mmol/l的葡萄糖和50μmol/l的二茂铁羧酸的ph为6.9的磷酸缓冲盐溶液滴到电极标签，进行测定并记录。

7.分别绘制两种检测方式的标准曲线，完成腺嘌呤核苷三磷酸的测定。

本发明的有益效果：

1.一种纸基双模式设备可对腺嘌呤核苷三磷酸进行快速和精准检测，降低了实验成本。

2.超级电容器通过数字万用表瞬间释放提供放大电流来提高灵敏度。

3.海胆状金纳米颗粒的使用，增大了比表面积及有效减少纸的背景荧光，提高了检测的灵敏度。

4.纸基传感器柔韧灵活，携带方便，可以剪裁、弯曲、折叠和可塑，后处理简单，不会对环境造成污染。

5.相比于传统的玻碳电极和玻璃电极，纸基材原料丰富、质量轻、廉价、易折叠、可降解。

附图说明：

下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述：

图1是疏水蜡打印图案上丝网印刷工作电极、参比电极、对电极、碳线。

图2是纸基设备超级电容器模式检测目标物折叠示意图。

图3是纸基设备电化学模式检测目标物折叠示意图。

具体实施方式

实施例1（来自人血清）

一种操作简单、检测速度快、成本低廉的纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法，包括以下步骤：

1.在计算机上利用adobeillustratorcs6软件设计一个十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的a4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水区域，样式如附图1所示，其中1为电极标签，2为检测区，3为中空区域，4为反应区，5为超级电容器标签。

2.采用丝网印刷的方法，将碳工作电极印刷到检测区，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到电极标签，碳电极印刷到反应区，碳线印刷到绿色区域作为工作电极和超级电容器的桥梁，将中空区域中疏水蜡包围的圆形亲水区域居中进行打孔；将红色区域的实线进行切割，虚线进行折叠，形成一个立体结构。

3.对检测区的圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长海胆状状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80ml二次水倒入三口烧瓶中加热至90℃，并加入800μl质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.8ml质量分数为1%的柠檬酸钠，继续加热15min，自然冷却得到金种子溶液，取20μl得到的金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次，将100μl200mmol/l的抗坏血酸和100μl质量分数为1%的氯金酸溶液混合，取20μl混合溶液滴加到修饰有金种子的工作区域，静置30min，用二次水冲洗3次，其次，取10μl100mmol/ldna1滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，在4℃下孵育一夜，用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液多次冲洗掉未固定的dna1，继续滴加10μl40nmol/l的aptamer在环境温度37℃下孵育50min，用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液pbs缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干，继续滴加10μl的1%的牛血清白蛋白进行封闭，在室温下反应50min，最后在工作区域修饰dna2/葡萄糖氧化酶复合物，具体步骤为：用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液来活化dna2，随后，将过量的戊二醛交联剂加入到含有1μmol/l的葡萄糖氧化酶的500mlph为7.3的25mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中，并将混合物摇动15min，通过用离心过滤装置分离纯化产物，随后加入100μmol/l的dna2反应2h，用离心过滤装置纯化所得产物，取10μl得到的dna2/葡萄糖氧化酶复合物滴加到检测区圆形亲水工作区域，并于37℃环境反应2h，将此工作区域用10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液冲洗以减少非特异性吸附，所述的dna1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰有1个氨基和6个亚甲基，所述的dna2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其3’端修饰有1个巯基和7个亚甲基。

4.在反应区圆形亲水区域进行修饰，具体步骤为：20μl100mmol/l的铁氰化钾滴加到圆形亲水区域，自然晾干，重复三次，继续滴加20μl100mmol/l的葡萄糖溶液，静置晾干，重复三次。

5.在超级电容器标签预留空白区域制作超级电容器，具体步骤为：首先，在超级电容器标签预留空白区域用碳铅笔均匀的涂覆，形成导电电极，随后，通过将6g用乙醇醇化的聚乙烯醇粉末，6g磷酸和60ml二次水混合在一起并加热至85℃直至溶液变澄清来制备固态电解液，将石墨涂覆的纸浸入固态电解液中恒定一段时间并取出，重复2~3次，紧接着置于蒸发皿中并在烘箱中干燥，当电解质干燥时，用碳铅笔将石墨涂覆在电解质上以形成夹层结构。

6.在检测区圆形亲水工作区域滴加含有腺嘌呤核苷三磷酸的待测溶液，自然晾干，其次，通过折叠将检测区与反应区域的圆形亲水区重叠，工作电极和碳线接触，用夹子固定，样式如图，10mmol/lph为7.4的磷酸缓冲盐溶液滴加到检测区圆形亲水工作区，通过数字万用表检测电流并记录，清洗检测区的圆形亲水工作区域之后，使检测区和电极标签重叠，用夹子固定，样式如图，与电化学工作站连接，将40μl含有10mmol/l的葡萄糖和50μmol/l的二茂铁羧酸的ph为6.9的磷酸缓冲盐溶液滴到电极标签，进行测定并记录。

7.分别绘制两种检测方式的标准曲线，完成腺嘌呤核苷三磷酸的测定。

序列表

<110>济南大学

<120>一种纸基双模电化学传感器检测腺嘌呤核苷三磷酸的方法

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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