检测肺癌或肠癌中特异性T细胞分泌的细胞因子的方法与流程

本发明属于医学检测应用技术领域，尤其涉及一种检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：

细胞因子(cytokine，ck)是由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。

当机体感染疾病时，一系列相关细胞因子通过协调参与机体的免疫应答过程。以结核免疫为例，结核分枝杆菌通过t淋巴细胞介导引起机体ⅳ型超敏反应，机体发挥t细胞免疫为主，多种细胞因子协同参与的免疫应答，主要由cd4+t细胞即t辅助性1型细胞(th1)和cd8+t细胞即t辅助性2型细胞(th2)介导。相关细胞因子包括肿瘤坏死因子(tnf)、白介素-2(il-2)、白介素-10(il-10)、干扰素-γ(ifn-γ)等。

通过检测记忆t细胞再次受特异性抗原刺激的反应程度，通常表现为分泌各类细胞因子，可以揭示机体感染疾病的状态，这是一种可靠的检测方法，如γ干扰素释放实验，是在体外检测t细胞经结合特异性抗原刺激之后产生和释放γ-干扰素能力的技术，借此判断细胞介导的免疫反应。刺激患者外周血单个核细胞使t淋巴细胞产生大量γ-干扰素，然后用酶联免疫斑点法检测γ-干扰素浓度。

利用抗原特异性t细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是今年发展起来的一种新的检测方法。通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培养，然后利用elispot检测能够分泌ifn-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。

(2)在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。

(3)体外检测t细胞存在检测时间过长的缺陷。

解决上述技术问题的难度：

(1)首先是关于样本的采集量，如何做到用最少的样本量，达到检测目的。

(2)其次是如何缩短整个体系的检测时间。

(3)最后如何在最少样本量以及最短时间内达到检测灵敏度。

解决上述技术问题的意义：对于解决上述技术问题的意义在于，能够实现在更短时间内，用最少量的样本，达到检测效果，从而提高检测效率。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法。

本发明是这样实现的，一种检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法，所述检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法包括以下步骤：

第一步，采集血液样本到肝素抗凝采血管中，混匀；

第二步，血液样本转移到新的离心管中，并加入等体积的生理盐水稀释；

第三步，准备新的离心管中加入ficoll-histopaque分离液，将离心管倾斜至30°，然后将第二步中稀释过后的血液样本沿离心管加入到分离液中；

第四步，将第三步准备好的样本在2500r/min下密度梯度离心30min，离心后分三层，吸出中间白色层到新的离心管中；加入生理盐水稀释，在1500r/min下离心10min，弃上清，加入生理盐水稀释，进行细胞计数；

第五步，将第四步中的细胞低速离心，在1200r/min下离心10min，弃上清，下层即为pbmc细胞；

第六步，用aim-v无血清培养基将得到的pbmc细胞重悬，然后将pbmc细胞进行6孔板贴壁培养2小时后，将上层非贴壁细胞吸出加入新孔中继续培养1小时；原孔中加入dc培养基和5％的血清进行培养；

第七步，培养1小时后，将上层细胞吸出加入到新的离心管中，1200r/min下离心10min后，计数后进行冻存；新孔中加入dc培养基和5％的血清继续培养；

第八步，到第三天，对培养的细胞进行半量换液，并加入等量的培养因子；

第九步，到第五天，将冻存的非贴壁进行复苏培养；根据所需要检测的多肽数量进行铺板，每孔细胞数为1x10⁵，培养24小时；

第十步，到第六天，诱导成为dc细胞，按照10:1的细胞数量，加入第九步复苏的非贴壁细胞中，每孔加入相应的多肽刺激培养；

第十一步，每隔三天进行半量换液，并加入相应比例的培养因子和多肽；

第十二步，刺激三轮后，用elispot检测试剂盒进行细胞因子的含量。

本发明的另一目的在于提供一种所述检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的系统，所述检测特异性t细胞的体系由检测样本、靶标、检测样本的刺激抗原和/或阳性对照抗原、检测样本的常规试剂组成；

所述检测样本为肝素抗凝的血液；样本量是5ml、10ml、15ml、20ml、30ml或40ml；

所述刺激抗原为刺激记忆性t细胞的特异性抗原；

所述阳性对照抗原为刺激免疫细胞的非特异性刺激剂；

所述常规试剂指的是检测细胞因子采用的常规检测试剂。

进一步，所述检测体系的靶标为细胞受刺激后分泌的物质。

进一步，所述的细胞受刺激后分泌的物质为细胞因子、趋化因子或蛋白中的任意一种或至少两种的组合；

所述刺激记忆性t细胞的特异性抗原为天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物、病毒特异性抗原或细菌特异性抗原中的任意一种或至少两种的组合。

进一步，细胞因子为免疫细胞和/或非免疫细胞受非特异性刺激剂刺激后分泌的细胞因子；

所述细胞因子具体为il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-17、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tnf-β、scf、g-csf、m-csf、gm-csf、神经白细胞素、iga、igg、穿孔素、颗粒素、ip10或tgf-β中的任意一种或至少两种的组合；

所述天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物是能够刺激细胞反应的过敏原。

进一步，所述免疫细胞可以选自但不限于t细胞、b细胞、nk细胞或巨噬细胞；

所述刺激免疫细胞的非特异性刺激剂选自刀豆素a、植物血凝素、人美洲商陆素、花生凝集素、大豆凝集素、葡萄球菌a蛋白的菌体、脂多糖或肿瘤刺激剂中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法在检测记忆性免疫细胞中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法在制备疾病检测和/或诊断的试剂盒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法在检测记忆性免疫细胞的分泌物质中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法在细胞因子检测的疾病中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)本发明通过分离外周血单核细胞，诱导成dc细胞后，将dc细胞和t细胞共培养，加入多肽刺激，检测特异性t细胞。

(2)本发明所提供的检测体系在刺激抗原终浓度一致的情况下，样本缩小到10ml的时候，相比于常规的20ml以上的样本体积，在减少样本的检测量时，不影响最后特异性t细胞的检测。

(3)本发明提供的检测体系使用方法简便，快速高效；能够缩短检测时间，提高检测效率。

(4)本发明所提供的检测体系的应用范围广泛，具有巨大的市场价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法的流程图。

图2是本发明实施例提供的elispot检测结果图。

图3是本发明实施例提供的不同样本量得到的pbmc细胞量示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法包括以下步骤：

s101：肺癌患者外周血分离后提取单核细胞。

s102：单核细胞诱导成dc细胞。

s103：dc细胞与t细胞共培养。

s104：加多肽刺激三次后检测特异性t细胞分泌的细胞因子。

下面结合具体实施例对本发明的技术效果作详细的描述。

本发明实施例提供的检测肺癌或肠癌中特异性t细胞分泌的细胞因子的方法包括以下步骤：

(1)肺癌病人外周血淋巴细胞多肽抗原刺激特异性t细胞产生的细胞因子ifn-γ检测，肺癌病人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液(ficoll-histopaque1.077)密度梯度离心(室温，400g，30分钟)，取中间白膜层细胞，置入50ml离心管中，用pbs洗细胞3次，获得外周血单个核细胞(pbmc)。所获得的单个核细胞用完全培养基悬浮pbmc，37℃、5％co2孵育2小时后，轻晃板子，吸出非贴壁细胞,冻存备用。

贴壁细胞用含人重组rhgm-csf(500u/ml)和人重组rhil-4(10ng/ml)的dc无血清培养基液，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。培养到第七天。同时复苏冻存的非贴壁细胞(富含淋巴细胞)，悬浮于10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，分别取至上述自体dcs中，于37℃、5％co2条件下共培养，加入il-2(100u/ml)，10％fbs以及多肽刺激培养。此为第一轮的刺激。培养过程中每隔3天加入一次il-2(100u/ml)，2－3天半量更换新鲜培养基。共三轮多肽刺激培养。

如图2所示，经过三轮共培养刺激后的细胞，用培养基调整细胞浓度为1×10⁵/m，细胞悬液直接转入包被有抗ifn-γ抗体的elispot检测板，200μl/孔，并加入相应的多肽。参照ifn-γelispot检测试剂盒说明书的方法检测分泌ifn-γ的t细胞集落。

(2)样本量的选取

由于患者的外周血样本极为珍贵，如何以最少的样本量，从而达到后续实验用于检测特异性t细胞再刺激后的分泌物。样本量可以是5ml、10ml、15ml、20ml、30ml或40ml。通过实验验证发现，当检测样本量在10ml时，能够确保后续分离的单核细胞(pbmc)数量达到1x10⁷，从而保证后续体系中能够达到合适数量的特应性t细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。