基于Au-Se界面的SERS传感器用于超灵敏高保真生物分子定量检测的制作方法

本发明属于生物检测和拉曼检测技术领域，具体涉及基于au-se界面的sers传感器用于超灵敏高保真生物分子定量检测。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

复杂的生物体系中生物分子的准确定量是生物学和分析化学等领域共同关注的重要问题。由于很多生物分子在生物体内含量较低，常用检测方法的低灵敏度成为检测低含量分子的瓶颈。此外，生物体内生理环境复杂、物质含量种类多，这对低含量生物分子的高保真检测造成了非常大的挑战。因此，发展高灵敏、高保真的生物分子检测方法一直我们追求的目标。

表面增强拉曼散射(sers)可通过电磁增强和化学增强的共同作用对拉曼信号分子实现10⁶-10¹⁴的信号增强。因此，基于sers构建的生物传感器为实现生物分子的高灵敏检测提供了极具潜力的解决途径。此外，拉曼信号分子的官能团可对应出现多个拉曼峰。因此，可以通过一个变化的信号峰和不变的内标峰进行比率检测，应用于复杂生物体系中生物分子的定量检测。目前，常用于构建sers生物传感器的基底是au和ag。两者都表现出长期稳定性、高效的sers增强和易于尺寸控制等优势。虽然与ag相比au基底显示出更强的sers信号，但是ag易氧化生成高毒性的ag⁺，妨碍了它在活体生物分析的应用。相比之下，au更易于表面功能化并且具有非常好的生物相容性，其在生物小分子，dna，蛋白质等生物大分子以及细菌，细胞分析方面皆展示了广泛的应用价值。对于sers增强及高保真检测来说，增强基底以及基底与分子的连接方式尤为重要。目前，常用的au与拉曼信号分子的组装方式有两种：一是au通过物理吸附连接拉曼信号分子，但是这种方法对探针的吸附量难以控制，且复杂环境也会影响其稳定性。另一种是au通过化学键连接拉曼信号分子。其中，基于au-s键连接是构建sers生物传感器是最常用的方式，如对小分子拉曼探针、dna的sh-修饰以及利用多肽或蛋白质的天然sh-与au进行连接，可构建应用于生物小分子、dna和蛋白质以及生物环境如ph等多种sers生物传感器，在体液、细胞等复杂体系中进行拉曼检测应用。但是生物体中含有大量的生物硫醇类物质(例如谷胱甘肽等)，而高浓度的生物硫醇类物质易通过配体交换反应取代通过au-s连接的拉曼探针，破坏sers生物传感器，干扰实验的可靠性和真实性，影响生物分子的高灵敏准确定量。因此，开发一种稳定的au与探针分子的连接方式，构建抗生物硫醇干扰的sers传感器，对准确定量检测生物体中生物分子极为重要。

作为硫族元素的成员，较重的se原子与s原子相比，具有更大的极化率，sers增强会更明显。与au-s键相比au-se键的能带宽，有利于电子从au到其硒醇修饰分子的转移，得到更稳定的au-se键。从而可以解决sers传感器的不稳定性问题。有报道利用au-se键代替au-s键构建纳米探针应用到了生物荧光分析中，但是依然不能解决低含量分子的在体高保真定量检测。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明提供了一种高保真定量检测au-sesers传感器用于复杂体系内生物分子超灵敏定量检测的方法。利用本发明可以避免生物硫醇类物质的干扰，用于生物分子的超灵敏高保真检测，并且可以实现细胞内生物分子高保真绝对定量检测，具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种au-se纳米探针，由aunp与seh-多肽链组装而成。

在一些实施例中，所述seh-多肽链通过au-se键连接到aunp的表面。

在一些实施例中，所述aunp采用柠檬酸钠还原法制备。

在一些实施例中，所述aunp的平均粒径约为23～27nm。

在一些实施例中，所述seh-多肽链为修饰有tamra标记的seh-多肽链。

在一些实施例中，所述seh-多肽链的序列如下：

tamra-acp-gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-[se-gys](seqidno.1)，其中，se-cys的-seh裸露。

本发明还提供了一种基于au-se界面的sers传感器，包括：

任一上述的au-se纳米探针。

本发明还提供了一种修饰有内标的核壳结构的sers传感器，所述sers传感器至少包括具有核壳结构的金纳米粒子，在金纳米粒子核壳间隙处修饰有内标分子1,4-苯二硫醇(1,4-bdt)；所述金纳米粒子壳表面通过au-se键修饰有上述tamra标记的seh-多肽链。

其中，所述具有核壳结构的金纳米粒子直径约为50nm，其内部金核结构直径约为22nm。

本发明还提供了一种定量检测mmp-2的方法，向任一上述的au-se纳米探针、或上述的sers传感器加入待测样品进行孵育，记录拉曼信号的变化值，计算出相应的mmp-2浓度。

本发明还提供了上述的修饰有内标的核壳结构的sers传感器在生物样品中mmp-2的绝对定量检测中的应用。

具体的，所述检测为sers光谱检测；所述生物样品包括生物离体活细胞。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用了一种新型的键合方式形成更稳定au-se的sers传感器，可为复杂生理体系中的生物分子的高灵敏、高保真检测提供新策略。

(2)本发明提供一种修饰有内标的核壳结构的sers传感器用于细胞活体的绝对定量检测。

(3)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是本发明的原理示意图；

图2是本发明实施例1的合成和表征图：(a)aunp的透射电镜图。(b)aunp、au-se探针和au-s探针的紫外-可见光谱图。(c)aunp、au-se探针和au-s探针的拉曼光谱图。(d)au-se探针的可行性分析光谱图。

图3是本发明实施例1的稳定性实验图：(a)时间对两种不同纳米探针的sers信号的影响。(b)温度对两种不同纳米探针的sers信号的影响。(c)在37℃时gsh对au-se探针的sers信号的影响。(d)在37℃时gsh对au-s探针的sers信号的影响。(e)gsh对两种不同纳米探针的sers信号的比较。(f)gsh和时间对两种纳米探针的sers信号的影响。

图4是本发明实施例1中的两种不同纳米探针定量检测mmp-2：(a)au-se探针对不同浓度的mmp-2的拉曼响应；(b)au-s探针对不同浓度的mmp-2的拉曼响应。

图5是本发明实施例2中的核壳纳米粒子的合成及表征：(a)核壳纳米粒子的合成示意图；(b)核壳纳米粒子合成流程的tem图像；(c)核壳纳米粒子合成流程的拉曼检测。

图6是本发明实施例2中(a)核壳纳米探针高保真绝对比率定量检测mmp-2；(b)比率标准工作曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有的au-se键构建的纳米探针不能解决低含量分子的在体高保真定量检测，不易于规模化生产的问题。因此，本发明提出一种更稳定的连接方式构建生物传感器，用于生物分子的高保真超灵敏检测。

设计构建了基于au-se结合的sers传感器避免生物硫醇类物质的干扰，用于生物分子的超灵敏高保真检测。修饰有tamra的seh-多肽链通过au-se组装到aunps表面，由于表面等离子体共振效应tamra表现出极强的拉曼信号，当mmp-2存在时，肽链被活化的mmp-2切割，tamra信号分子远离aunps导致拉曼信号降低。与au-s拉曼纳米探针相比，au-sesers传感器具有更好的抗生物硫醇干扰。

本发明的第二个方面，提供一种修饰有内标的核壳结构的sers传感器用于细胞活体的绝对定量检测。

为了进一步实现细胞和活体内生物分子高保真绝对定量检测，构建了一个具有核壳结构的比率sers传感器，该纳米传感器核壳间隙处修饰内标分子1,4-bdt；在纳米传感器表面通过au-se修饰tamra标记的多肽链用于实时响应细胞内的mmp-2，通过1,4-bdt与tamra的拉曼信号比值，成功实现了活细胞内mmp-2的高保真定量检测。上述所提出的基于au-se的sers传感器，为复杂的生物体系中生物分子的高灵敏、高保真绝对定量检测提供了新的策略和途径。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。下述各实施例中检测条件如下：使用600nm光栅的共聚焦拉曼显微镜(labramhrevolution，horiba)获得sers光谱和sers成像实验。使用在λ＝633nm处运行的he-ne激光器和50倍长的物镜，在25℃下获得sers光谱和sers成像实验。对于每个拉曼光谱和成像，激光输出功率为10mw，收集时间为5s，光谱采集范围是800-1700cm^-1。

实施例1

一种新型的键合方式形成更稳定au-se的sers传感器，可为复杂生理体系中的生物分子的高灵敏、高保真检测提供新策略。

(1)探针的合成和表征图

首先，利用柠檬酸钠还原法制备了新鲜的aunps(将1g氯金酸定容于100ml的容量瓶中即得到质量分数为1％的氯金酸溶液，用移液枪精确取1ml质量分数为1％的氯金酸，加入到棕色容量瓶中，然后用超纯水定容至100ml即可。我们在进行制备质量分数为1％的柠檬酸钠溶液时，称取1.13037g的柠檬酸钠固体，加入到100ml的容量瓶中，然后加入超纯水并超声使其完全溶解，充分摇匀。然后将100ml三口烧瓶固定在智能磁力搅拌器上方，并向三口烧瓶中加入磁子，注意烧瓶不要触碰到搅拌器底部，连接好回流冷凝装置，把配置好的100ml0.01％的氯金酸溶液倒于三口烧瓶中，打开加热搅拌装置并连通冷凝装置，当溶液出现均匀连续的气泡时，快速地加入柠檬酸钠溶液，溶液迅速由淡黄色变为深黑色，最后逐渐变为澄清的酒红色，变为酒红色后维持加热30min，至还原反应完全，停止加热后，冷凝装置继续工作，直到自然冷却至室温)，并且对其进行了tem表征，结果如图2a所示，tem图清晰显示了金纳米粒子具有良好的分散性并且大小均匀，其平均粒径约为25nm左右，表明我们成功制备了aunps。aunp与-seh多肽进行组装(将质量分数(10％)的十二烷基硫酸钠(sds)添加到aunps(3nm)溶液中，最终质量分数为0.1％，将混合物放置于加有磁子的三口烧瓶中，搅拌约30分钟。将修饰有tamra拉曼分子的硒醇肽链添加到混合物中，硒醇修饰的肽链的最终浓度为1nm。在黑暗中搅拌混合物约48小时，实现aunps与-seh多肽组装。通过以10,000rpm离心20分钟除去过量的试剂。然后，将红色沉淀物洗涤并离心3次)，制备了au-se纳米探针。紫外-可见吸收光谱显示裸au纳米颗粒的最大吸收峰为520nm，而功能化的au-se纳米探针最大吸收峰为524nm，因此表明，功能化的au-se纳米探针成功制备(如图2b所示)。与裸au相比，制备好的au-se纳米探针在拉曼光谱中有明显的tamra信号峰，这是由于aunps表面修饰上了有tamra信号的-seh多肽(如图2c所示，tamra-acp-gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-[se-gys])。与此同时也将-sh多肽组装到aunps，发现au-s探针在紫外-可见吸收光谱中也产生了微小的红移，在拉曼检测中也有明显的tamra信号峰。au-se纳米探针具有很强的拉曼信号，将mmp-2加入到au-se纳米探针中，信号略有下降，将胶原酶潜酶活化剂(apma)活化的mmp-2加入到au-se纳米探针中，拉曼信号有很大的降低，表明活化后的靶蛋白可以在特定的切割位点切割肽链，使大量tamra信号分子远离金纳米粒子，从而导致信号降低(如图2d所示)。

(2)探针稳定性实验

纳米探针的稳定性显著影响它们在复杂实际样品和生物体内应用的准确性。因此，为了验证纳米探针自身的稳定性，两种探针(1nm)分别在37℃下反应不同时间，当探针反应0-12h时，au-se探针的拉曼信号基本保持不变，而au-s探针的拉曼信号有明显的信号减弱(如图3a所示)，结果表明au-se探针具有更好的自身稳定性。为了测试探针的热稳定性，将两种纳米探针(1nm)分别在不同温度(20-70℃)下孵育20分钟进行拉曼检测，20-40℃时，两种纳米探针信号的拉曼强度随温度的升高几乎不发生变化。在40-70℃时，au-s纳米探针与au-se纳米探针相比，au-s纳米探针的拉曼强度随着温度升高显著降低。这种现象是由较高的活化能引起的，通过提高温度来降低au-s键的稳定性，从而破坏键以使肽链脱离aunps，从而拉曼信标tamra远离，使拉曼信号降低(如图3b所示)。

为了测试探针在模拟生理条件gsh下影响，在au-se探针与au-s探针中加入5mmgsh，当5mmgsh与au-se探针混合时，拉曼强度几乎没有变化(如图3c所示)；相反，观察到au-s探针的拉曼信号明显降低(如图3d所示)，这是由于gsh与-sh多肽发生竞争，使一部分-sh多肽脱落导致信号降低。反应前后两种探针的拉曼信号结果如图3e所示，实验结果显示在模拟的生理条件下，au-se纳米探针对高浓度的生物硫醇具更高的稳定性。此外，我们还探索了两种探针与5mmgsh孵育不同的时间(0-12h)拉曼信号的变化。与au-se探针相比，由于gsh与-sh多肽发生竞争取代，au-s探针有显著降低的拉曼信号(在12小时时比au-se探针信号降低了2倍，如图3f所示)。

(3)两种不同纳米探针定量检测mmp-2

为了研究au-se纳米探针在5mmgsh影响下对靶蛋白mmp-2的响应，在37℃下，向au-se纳米探针中加入5mm的gsh并与不同浓度的mmp-2一起孵育。如图4a所示，au-se纳米探针随着mmp-2浓度的增加，tamra拉曼信号显著降低，这是由于靶蛋白特异性识别并切割肽链使tamra远离金纳米粒子等离子体，从而引发拉曼信号降低。au-se探针对不同浓度的mmp-2的响应范围为10pg/ml～100ug/ml。检测限为1.7pg/ml。而如图4b所示，au-s探针对不同浓度的mmp-2的响应范围为100pg/ml～100ug/ml。检测限为63pg/ml。因此，结果证明在5mmgsh影响下au-se探针更适用于低浓度mmp-2的分析，这是由于au-se探针中的-seh多肽不会被gsh竞争取代，而au-s探针中的-sh多肽会被gsh取代，影响了探针的准确性。

实施例2

一种修饰有内标的核壳结构的sers传感器用于细胞(肺腺癌细胞a549)活体的绝对定量检测。

(1)核壳纳米粒子的合成及表征为了进一步实现细胞和活体内高保真、绝对定量检测，构建一个有内标分子的核壳纳米材料，这个核壳纳米粒子间隙处修饰上了内标1,4-bdt分子，可以保护内标分子免受生理环境的影响，核壳纳米粒子合成过程如图5a所示，具体制备方法如下：(a)金核的合成。金核是通过种子生长法合成。首先通过剧烈混合4.5ml水、5mlctac溶液(0.2m)、450μlnabh4溶液(0.02m)和515μlhaucl4(4.86mm)来制备种子溶液。将种子溶液在30℃下保持1小时，并进一步稀释10倍。然后通过混合10mlctac溶液(0.1m)、515μlhaucl4(4.86mm)和75μl抗坏血酸(0.04m)制备种子生长溶液。在超声处理下将100μl稀释的种子溶液添加到种子生长溶液中，保持黑暗两天，以获得高度均匀的球形纳米颗粒。在该阶段获得的au核的尺寸为约22nm。(b)金核壳的合成。将au核(1nm)洗涤一次以除去过量的ctac，然后将其重新分散在水中。将1，4-bdt粉末溶解在乙醇中。然后在超声处理下将400μl的2mm1,4-bdt分子溶液缓慢添加到10mlau核心(1nm)溶液中。将1,4-bdt分子修饰的核心离心洗涤3次以去除多余的分子，然后将其重新分散在ctac溶液(0.1m)中得金核上修饰有1,4-bdt的溶液。通过在2mlctac溶液(0.1m)、100μl抗坏血酸(0.04m)和100μlhaucl4(4.86mm)的混合生长溶液中加入120μl上述金核上修饰有1,4-bdt的溶液来制备金壳。剧烈的超声处理。核壳纳米材料的尺寸约为50nm。(c)核壳纳米探针的制备：将质量分数(10％)的十二烷基硫酸钠(sds)添加到核壳纳米粒子溶液中，最终质量分数为0.1％，将混合物放置于加有磁子的三口烧瓶中，搅拌约30分钟。将修饰有tamra拉曼分子的硒醇肽链添加到混合物中，硒醇修饰的肽链的最终浓度为1nm。在黑暗中搅拌混合物约48小时，实现核壳纳米粒子与-seh多肽组装。通过以10,000rpm离心20分钟除去过量的试剂。然后，将沉淀物洗涤并离心3次，备用。

核壳纳米粒子通过透射电子显微镜(tem)和拉曼光谱仪共同监测核壳纳米粒子合成过程(如图5b、5c所示)。从tem图中可以看到核壳纳米粒子中间有超微小的内部间隙并且检测该核壳纳米粒子具有1,4-bdt的拉曼信号峰，证明核壳纳米粒子制备成功。

(2)核壳纳米探针高保真绝对定量检测mmp-2

为了研究核壳纳米探针在5mm的gsh影响下对靶蛋白mmp-2的响应，在37℃下，在探针中加入5mm的gsh并与不同浓度的mmp-2(10pg/ml～100ug/ml)一起孵育。在这个过程中1,4-bdt的特征峰(1055cm^-1)一直保持不变，而修饰有tamra信标的au-se探针当存在有mmp-2时tamra的特征峰(1370cm^-1)随mmp-2浓度的增大而逐渐降低。在这个过程中我们发现变化的tamra特征峰与不变的1,4-bdt特征峰的比值在10ng/ml～10ug/ml范围内呈现良好的线性关系(图6a、6b所示)。检测限为0.71pg/ml，r＝0.993。结果表明，核壳au-se探针在gsh干扰下可以高保真并且绝对定量检测mmp-2。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

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